血管緊張素Ⅱ?qū)CNQ1-KCNE1鉀通道蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、延遲整流鉀電流IK是人和哺乳動(dòng)物的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位主要的復(fù)極外化向鉀電流，其中包括兩種電流成分：慢激活(Slow delayed rectifierpotassium current，IKs)和快激活(Rapid delayed rectifier potassiumcurrent，IKr)。目前認(rèn)為KCNQ1編碼的α亞單位和KCNE1編碼的β亞單位共同構(gòu)成IKs鉀通道。KCNQ1屬于Kv鉀通道家族KCNQ成員之一(KCNQ1-5或K

2、v7.1-7.5)。KCNQ1異源表達(dá)能產(chǎn)生快激活、慢失活的外向電流。迄今發(fā)現(xiàn)的五種KCNE蛋白都能夠?qū)CNQ1通道功能起不同的調(diào)節(jié)作用，其中KCNQ1/KCNE1異源表達(dá)形成慢激活、慢去激活、無失活的電流，其電流動(dòng)力學(xué)特征和藥理學(xué)特征與心臟的IKs通道很相似。
　　業(yè)已證明，KCNQ1及KCNE1基因突變是引發(fā)離子通道病的分子遺傳基礎(chǔ)，包括通道功能下調(diào)相關(guān)的長QT綜合征(LQT1、LQT5)或功能上調(diào)引發(fā)的短QT綜合征(SQT

3、2)。同時(shí)，越來越多的證據(jù)顯示，許多心血管疾病狀態(tài)下，如心肌肥厚，心衰等伴有IKs通道功能的下調(diào)，是獲得性LQT產(chǎn)生的重要原因之一。無論是復(fù)極延遲的LQT或是復(fù)極縮短的SQT，都可能導(dǎo)致心律失常，特別是尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速，是高發(fā)心源性猝死的危險(xiǎn)。因此研究IKs通道功能調(diào)節(jié)具有重要的意義。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的正常生理功能以及高血壓、心肌肥大、充血

4、性心力衰竭等諸多心血管的病理過程中具有重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是其該系統(tǒng)的主要體液因子，近年的研究表明AngⅡ?qū)π募‰x子通道功能具有直接調(diào)控作用。在先前我們的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過激活A(yù)T1受體對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞上IKs呈急性下調(diào)，已知AT1受體激動(dòng)產(chǎn)生的效應(yīng)包括急性作用(發(fā)生在幾分鐘內(nèi))和慢性作用，后者常常為基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。然而AngⅡ?qū)Ks通道的慢性調(diào)控作用尚不清楚。本研究用分子生物學(xué)、免疫熒光顯微鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在

5、異源表達(dá)體人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)上共表達(dá)人的KCNQ1、KCNE1以及人AT1受體cDNA，24h后，觀察AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1通道慢性調(diào)控作用，并分析了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
　　第一部分AngⅡ?qū)CNQ1通道蛋白表達(dá)的影響
　　目的：觀察不同濃度及不同時(shí)間AngⅡ?qū)CNQ1通道蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：在HEK293細(xì)胞上運(yùn)用Lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染帶標(biāo)簽的V5-KCNQ1

6、或Myc-KCNQ1、KCNE1及人AT1受體cDNA，24h后，運(yùn)用特異性抗標(biāo)簽抗體，western blot技術(shù)檢測(cè)AngⅡ在不同濃度、不同時(shí)間對(duì)KCNQ1通道蛋白表達(dá)的影響。運(yùn)用免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察AngⅡ?qū)?xì)胞膜上通道蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)AngⅡ與細(xì)胞孵育24h可明顯降低KCNQ1蛋白含量，AngⅡ在10、100、1000 nM濃度下蛋白含量分別是對(duì)照的80％、68％、67％，；(2)AngⅡ(100

7、 nM)不同時(shí)間(2、6、12、24h)孵育后通道蛋白的下調(diào)出現(xiàn)在12小時(shí)；(3)免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，給予AngⅡ(100nM)24h后，細(xì)胞膜上的通道蛋白熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　結(jié)論：在異源表達(dá)系統(tǒng)，長時(shí)間孵育AngⅡ能夠引起KCNQ1通道蛋白的表達(dá)量下降。
　　第二部分 PKC信號(hào)通路對(duì)AngⅡ作用的影響
　　目的：異源表達(dá)細(xì)胞線上分析AngⅡ?qū)CNQ1通道慢性調(diào)控作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：

8、采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，在HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染帶標(biāo)簽的V5-KCNQ1、KCNE1及人AT1受體cDNA24h后，運(yùn)用特異性抗標(biāo)簽抗體，western blot技術(shù)檢測(cè)觀察使用PKC抑制劑或激動(dòng)劑對(duì)AngⅡ下調(diào)KCNQ1通道蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)PKC抑制劑Bis-1(100nM)與細(xì)胞孵育30min后再加入AngⅡ(100nM)共同作用24h，與單獨(dú)孵育AngⅡ相比通道蛋白表達(dá)含量出現(xiàn)了明顯增加現(xiàn)象，說明Bis-1

9、可拮抗AngⅡ的作用；(2)PKC激動(dòng)劑PMA(100nM)細(xì)胞孵育30min后再加入AngⅡ(100nM)共同作用24h，與單獨(dú)孵育AngⅡ相比通道蛋白表達(dá)量亦明顯增加，其蛋白含量為對(duì)照組的97％，表明長時(shí)間孵育PMA使PKC耗竭后可拮抗AngⅡ的作用；(3)單用PKC激動(dòng)劑PMA分別作用細(xì)胞30min及24h，PMA作用30min的蛋白含量為對(duì)照相的49％，而24h蛋白的表達(dá)含量為對(duì)照組的95％；PKC激動(dòng)劑OAG孵育30min及2

10、4h后，通道蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照的46％和40％，表明直接激動(dòng)PKC下調(diào)通道蛋白表達(dá)，PMA具較強(qiáng)的PKC激活作用，長時(shí)間孵育導(dǎo)致PKC耗竭后其下調(diào)作用消失。
　　結(jié)論：AngⅡ通過激動(dòng)AT1受體、激活PKC信號(hào)通路而下調(diào)KCNQ1通道蛋白。
　　第三部分 KCNE1-S102突變對(duì)AngⅡ作用的影響
　　目的：因近期有研究顯示，PKC可通過KCNE1上S102磷酸化加速通道蛋白入胞降解，本實(shí)驗(yàn)觀察在AngⅡ?qū)ν蛔兺ǖ?/p>

11、KCNQ1/KCNE1-S102A的作用，分析AngⅡ調(diào)節(jié)通道蛋白的可能機(jī)制。
　　方法：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，在HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染帶標(biāo)簽的V5-KCNQ1、KCNE1、KCNE1-S102A及人AT1受體cDNA24h后，運(yùn)用特異性抗標(biāo)簽抗體，應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)KCNQ1蛋白含量，比較AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE1-S102A通道作用的差別。
　　結(jié)果：共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-KC