MicroRNA-30a-5p對肝癌細胞增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝細胞肝癌（hepataocellular carcinoma, HCC）是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、預(yù)后差、侵襲性強等特點。深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，試圖為肝癌的診治提供新的思路。
　　MicroRNA(miRNA)是一類大小約為19-25bp的非編碼單鏈小分子RNA，在不破壞mRNA穩(wěn)定性的前提下通過與靶標(biāo)基因mRNA3'UTR完全或不完全互補配對，進而抑制或阻斷靶基因翻譯。mi

2、RNA具有高度時序性、保守性、組織特異性的特點，單一miRNA可調(diào)控多個靶基因，同時也可能一個靶基因受到多個miRNA的調(diào)控。通過大量肝癌組織與正常肝組織miRNA表達譜的比較發(fā)現(xiàn)，其中有一部分miRNA表達上調(diào)，有一部分表達下調(diào)，上調(diào)的miRNA可能起著促癌基因的作用，而表達下調(diào)的miRNA則可能起著抑癌基因的作用。
　　篩查肝癌患者的miRNA譜，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織對比，miRNA-30a、-30b、-30c、-30e等表達明顯

3、下調(diào)，特別是在已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中，下調(diào)更甚，這提示 miRNA-30家族表達下調(diào)與肝癌的形成可能有一定的聯(lián)系。目前 miRNA-30家族成員在肝癌中的具體作用機制研究較少。其中，家族成員之一miRNA-30a-5p在其他腫瘤中常見報道，因此我們挑選miRNA-30a-5p為研究對象，檢測其對肝癌細胞SMCC-7721增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：
　　1.采用 RT-qPCR檢測 miRNA-30a-5p

4、在肝癌組織中與正常肝組織中的表達差異；
　　2.采用 RT-qPCR檢測 miRNA-30a-5p在肝癌細胞株中與正常肝細胞株中的表達差異；
　　3.采用轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達肝癌細胞株內(nèi)miRNA-30a-5p的表達水平；
　　4.采用 CCK-8、流式細胞術(shù)、Transwell遷移侵襲實驗對miRNA-30a-5p進行體外功能分析，觀察過表達miRNA-30a-5p后肝癌細胞株的生物學(xué)行為變化；
　　5.采用裸鼠成瘤

5、實驗對miRNA-30a-5p進行體內(nèi)功能分析，觀察過表達miRNA-30a-5p后肝癌細胞對裸鼠成瘤的影響；
　　6.采用生物學(xué)信息技術(shù)預(yù)測 miRNA-30a-5p的靶標(biāo)基因，Western Blot技術(shù)進行初步驗證。
　　結(jié)果：
　　1.通過RT-qPCR分別檢測48例手術(shù)肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本及10例正常肝組織標(biāo)本中miRNA-30a-5p的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在肝癌組織中的相對表達量（0.3

6、1367±0.0568)低于癌旁肝組織(0.61226±0.0954）、正常肝組織(1.0733±0.0412)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）,RT-qPCR分別檢測7種肝癌細胞株SMCC-7721、Huh7.0、HepG2、HCCLM3、HCCLM6、MHCC-97H、MHCC-97L及正常肝細胞株L02中miRNA-30a-5p的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在7種肝癌細胞株的相對表達量均低于正常肝細胞株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

7、（p<0.05）；
　　2.通過轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p mimics入肝癌細胞株SMCC-7721細胞， CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p過表達后可以抑制SMCC-7721細胞的增殖能力（P<0.05），流式細胞術(shù)顯示 miRNA-30a-5p過表達促進了細胞凋亡，細胞周期出現(xiàn)了 S期阻滯，Transwell遷移侵襲實驗表明， miRNA-30a-5p過表達可以抑制SMCC-7721細胞的體外遷移、侵襲能力(p<0

8、.05)；
　　3.通過裸鼠成瘤實驗，觀察到肝癌細胞 SMCC-7721在轉(zhuǎn)染miRNA-30-5p后，裸鼠皮下腫瘤的生長明顯減緩，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白組相比較，腫瘤的大小、質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miRNA-30a-5p的可能靶基因，并利用western blot技術(shù)初步驗證了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methltransferase3A）可能是miRNA-30a-5p的靶基因。