銻劑治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的優(yōu)勢(shì)作用研究.pdf

1、目的:
　　1）研究銻劑在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)中的作用，探究銻劑對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)而證明銻劑具有治療APL作用。
　　2）通過(guò)探討銻劑對(duì)PML突變體（例如A216V和L218P;砷劑耐藥性突變體）的降解作用，發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)降解PML突變體的銻化合物。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞后，使用三氧化二銻（簡(jiǎn)稱(chēng)銻劑）或砷劑（陽(yáng)性對(duì)照）暴露NB4細(xì)胞，通過(guò)MTT法，瑞氏-吉姆

2、薩染料染色，流式細(xì)胞術(shù)，Western Blot，免疫熒光等方法檢測(cè)NB4細(xì)胞的增值抑制，分化、凋亡等指標(biāo)變化。使用免疫熒光法檢測(cè)銻劑對(duì)核小體形成的影響。利用HEK293T或HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Flag-PML或Flag-PML-RARα基因，過(guò)表達(dá)PML或PML-RARα融合蛋白，研究銻劑（或砷劑）對(duì)PML蛋白的溶性改變和降解作用。主要以RIPA buffer和LDS buffer分別提取可溶上清蛋白（RIPA可溶部分）和不溶沉淀蛋白（

3、RIPA不可溶部分）。使用Western Blot法分別檢測(cè)PML和PML-RARα融合蛋白在RIPA可溶和不溶部分中的變化和后修飾變化。
　　結(jié)果:
　　1）銻劑對(duì)NB4細(xì)胞的作用結(jié)果;MTT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，銻劑的細(xì)胞毒性明顯弱于砷劑，而且銻劑有較強(qiáng)的誘導(dǎo)NB4細(xì)胞CD11b的表達(dá)（早有粒細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白）。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)銻劑可使NB細(xì)胞核形態(tài)變化，證明銻劑具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化作用。隨著銻劑暴露濃度的增加，胞形

4、態(tài)出現(xiàn)了凋亡的特征，證明銻劑具有一定的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Western Blot和免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，銻劑同樣可導(dǎo)致PML-RARα融合蛋白的溶性發(fā)生改變，最終降解其蛋白融合蛋白;而且出現(xiàn)大顆粒狀的PML核小體，并且與SUMO-1共定位于細(xì)胞核，提示銻劑可促使PML-RARα融合蛋白進(jìn)入PML核小體，進(jìn)而促進(jìn)融合蛋白的降解，其作用類(lèi)似于砷劑。
　　2）銻劑對(duì)PML或PML-RARa過(guò)表達(dá)293T細(xì)胞體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果;分別用不同濃

5、度的銻劑或不同時(shí)間處理PML和PML-RARa過(guò)表達(dá)293T細(xì)胞，銻劑同樣能夠改變PML或PML-RARa融合蛋白的溶性改變，與NB4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。
　　3）銻劑和PSO（銻化合物）對(duì)PML突變體的作用結(jié)果;銻劑和砷劑都無(wú)法誘導(dǎo)PML突變體(A216V或L218P)的溶性改變或降解，而新型銻化合物PSO具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)PML突變體的溶性發(fā)生改變。
　　結(jié)論:銻劑具有類(lèi)似于砷劑誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞的分化的作用