組織因子途徑抑制物(TFPI)對大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、腎小球硬化是各種原因所致。腎小球損傷和病變的共同結(jié)局，其重要的病理特征之一是腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常沉積。ECM合成/降解失衡以及ECM代謝調(diào)控的異常是導(dǎo)致腎小球硬化發(fā)生的重要機(jī)制。腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell，MsC)在腎小球內(nèi)ECM代謝及調(diào)控過程中起重要作用。因此，加速和調(diào)控。腎小球系膜細(xì)胞的凋亡以及探討其與腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系是近年來對系膜增生型腎小球腎

2、炎的研究熱點(diǎn)之一。
　　 腎小球系膜細(xì)胞作為腎小球內(nèi)功能活躍的固有細(xì)胞之一，其增生和凋亡失衡在腎小球損傷和腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵性作用。體內(nèi)外大量研究表明，反復(fù)或持續(xù)性腎小球損傷導(dǎo)致的持續(xù)性MsC增生能加速并且導(dǎo)致系膜區(qū)ECM沉積增加，引起不可逆性腎小球損傷，終致腎功能喪失。近來研究結(jié)果提示，抑制MsC增殖，促進(jìn)MsC凋亡可以限制系膜增生型腎小球。腎炎的發(fā)展。腎小球內(nèi)MsC異常增生受到抑制后，Ⅳ型膠原、Laminin

3、及Fibronectin明顯減少，系膜區(qū)ECM沉積亦減少，從而限制了疾病的發(fā)展。
　　 組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是體內(nèi)主要的生理性抗凝物質(zhì)之一。TFPI能特異性地與FXa以及FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合，形成TFPI-FXa-FVIIa-TF四元復(fù)合物，滅活FVIIa-TF復(fù)合物的活性，發(fā)揮負(fù)反饋性抑制外源性凝血途徑的作用。除了其主要的抗凝作用外，TFPI還具有

4、抗炎、抗血管生成、抗增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生理功能。體外研究結(jié)果提示，TFPI能抑制培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞增殖，并且也能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)國外研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的人MsC能分泌TFPI，并且能有效地抑制TF的活性，從而抑制纖維蛋白的形成。TFPI對于治療腎小球腎炎也具有重要意義。臨床研究表明，在人新月體型腎小球腎炎中TFPI表達(dá)明顯上升，因此推測它在治療纖維蛋白依賴性腎小球腎炎中有重要意義。
　　 本課題采用制備大

5、鼠抗Thy-1腎炎模型、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光、Western blot、基因轉(zhuǎn)染、PCR等實(shí)驗(yàn)方法，分別從體內(nèi)、體外兩方面觀察TFPI在腎小球腎炎發(fā)展過程中的表達(dá)；觀察rTFPI對大鼠MsC凋亡的影響，并初步探討這種作用所涉及的信號通路，以期能探討和初步明確rTFPI在腎小球腎炎、腎小球硬化等病理過程中的作用及意義，并為系膜增生型腎小球腎炎臨床治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 TFPI的基因表達(dá)和產(chǎn)物

6、純化
　　 目的：獲得高純度的重組TFPI(recombinant TFPI，rTFPI)。
　　 方法：擴(kuò)增TFPI基因，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-TFPI，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)重組TFPI，用離子交換層析法純化重組TFPI，Western blot對純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，稀釋凝血酶原時(shí)間法檢測重組TFPI的抗凝活性。
　　 結(jié)果：大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)重組TFPI，后者以

7、包涵體形式存在于菌體內(nèi)，dPT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與對照組相比，重組TFPI PT延長16.2s。
　　 小結(jié)：大腸桿菌BL21(DE3)成功表達(dá)重組TFPI，經(jīng)復(fù)性、純化后重組TFPI純度大于95％，并具有較高的抗凝活性。
　　 第二部分 TFPI在大鼠抗Thy-1腎炎模型及人腎小球腎炎中的表達(dá)及其對腎小球MsC凋亡的影響
　　 目的：探討TFPI在大鼠抗。Thy-1系膜增生型腎小球腎炎模型以及人腎小球輕微病變和系膜增生

8、型腎小球腎炎組織腎小球中的表達(dá)；明確TFPI對腎小球MsC凋亡的影響：尋找TFPI蛋白中誘導(dǎo)MsC凋亡的功能區(qū)。
　　 方法：制備兔抗大鼠Thy-1抗血清，并利用該抗血清復(fù)制大鼠抗Thy-1腎小球腎炎模型，收集人腎小球輕微病變和系膜增生型腎小球腎炎腎穿活檢標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)結(jié)合圖像分析的方法，觀察內(nèi)源性TFPI的表達(dá)。外源性加入rTFPI、rTFPI1-161(包含TFPI N末端和第一、二結(jié)構(gòu)域KD1、KD2)、MBP-T

9、FPI162-276(包含TFPI第三結(jié)構(gòu)域KD3和C末端)、MBP-TFPI KD3、MBP-TFPI C末端刺激培養(yǎng)的大鼠腎MsC，采用Hoechst33258染色、流式細(xì)胞分析技術(shù)、DNA片段凝膠電泳(DNA Ladder)以及Western blot等方法分析MsC凋亡情況。
　　 結(jié)果：大鼠抗Thy-1腎小球腎炎模型中，腎小球內(nèi)TFPI在腎炎第14天顯著表達(dá)，21天表達(dá)更明顯，28天到達(dá)高峰。與人腎小球輕微病變腎穿組織

10、相比，系膜增生型腎小球腎炎組織腎小球內(nèi)TFPI的表達(dá)明顯增高。經(jīng)外源性rTFPI刺激后，凋亡的MsC數(shù)量明顯增加，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，分別為對照組的2.1、3.0、4.9倍，rTFPI作用組出現(xiàn)明顯的階梯狀DNA條帶，活性形式的Caspase-3蛋白表達(dá)也明顯高于對照組，并呈劑量依賴性表達(dá)。外源性加入rTFPI、rTFPI1-161、MBP-TFPI162-276、MBP-TFPIKD3、MBP-TFPI C末端后，rTFPI組、M

11、BP-TFPI162-276組、MBP-TFPI C末端組可見明顯的MsC凋亡現(xiàn)象，而rTFPI1-161組、MBP-TFPI KD3組無明顯MsC凋亡。
　　 小結(jié)：大鼠抗Thy-1腎小球腎炎模型中，腎小球內(nèi)TFPI于炎癥后期開始表達(dá)，并隨著炎癥時(shí)間的延長而表達(dá)增加；人系膜增生型腎小球腎炎中腎小球內(nèi)TFPI的表達(dá)高于腎小球輕微病變者；外源性rTFPI能誘導(dǎo)大鼠MsC發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，PDGF刺激MsC增殖后rT

12、FPI仍具有該作用；rTFPI誘導(dǎo)MsC發(fā)生凋亡的功能區(qū)位于其C末端。
　　 第三部分 rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡的相關(guān)信號通路的初步研究
　　 目的：探討rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡是否與組織因子(tissue factor，TF)有關(guān)；對rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡所涉及的信號通路進(jìn)行初步研究。
　　 方法：采用免疫細(xì)胞熒光的方法通過激光共聚焦觀察rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡是否是通過與細(xì)胞膜上的TF結(jié)合來完成的；采用We

13、stern blot的方法檢測rTFPI刺激MsC發(fā)生凋亡后，線粒體信號通路蛋白Bcl-2、死亡受體Fas以及PI3K-Akt信號通路的表達(dá)改變；用Fas中和抗體阻斷Fas通路后，采用Hoechst33258染色觀察MsC凋亡變化；采用RT-PCR、酶切、連接方法，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPc1-Akt1，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至MsC中，篩選出Akt1高表達(dá)克隆，用外源性rTFPI分別刺激正常MsC、轉(zhuǎn)染空載pEGFPc1的MsC以及轉(zhuǎn)染pEG

14、FPc1-Akt1的MsC，采用Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞分析技術(shù)觀察三組MsC凋亡情況。
　　 結(jié)果：外源性rTFPI刺激MsC后進(jìn)行免疫熒光檢測，rTFPI以紅色熒光標(biāo)記，MsC細(xì)胞膜上TF以綠色熒光標(biāo)記，兩者未疊加；外源性rTFPI刺激MsC凋亡后，線粒體信號通路蛋白Bcl-2表達(dá)不變，死亡受體Fas表達(dá)增加，并呈現(xiàn)劑量依賴性，加入Fas中和抗體阻斷死亡受體Fas通路后，rTFPI誘導(dǎo)的MsC凋亡作用減弱：

15、Western blot結(jié)果顯示，rTFPI刺激MsC發(fā)生凋亡后，磷酸化Akt、磷酸化IκB表達(dá)均明顯減弱；構(gòu)建pEGFPc1-Akt1真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MsC后獲得Akt1高表達(dá)克隆。將外源性rTFPI分別刺激正常MsC、轉(zhuǎn)染空載pEGFPc1的MsC以及轉(zhuǎn)染pEGFPc1-Akt1的MsC，Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，正常MsC組和轉(zhuǎn)染空載pEGFPc1-MsC組細(xì)胞凋亡明顯，而轉(zhuǎn)染pEGFPc1-

16、Akt1-MsC組細(xì)胞凋亡被明顯抑制。
　　 小結(jié)：外源性rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡與TF起始的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑無關(guān)。線粒體信號通路蛋白Bcl-2不參與rTFPI誘導(dǎo)的MsC凋亡，而死亡受體Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與該過程，阻斷該通路后，rTFPI誘導(dǎo)的MsC凋亡作用可被明顯抑制；rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡后，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Akt和IκB磷酸化明顯被抑制，上調(diào)MsC中Akt1表達(dá)可拮抗rTFPI引起的MsC凋亡，

17、提示PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也是參與rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。
　　 結(jié)論：
　　 1.MsC可表達(dá)和分泌TFPI：在大鼠抗Thy-1腎炎模型標(biāo)本中，腎小球內(nèi)TFPI表達(dá)于炎癥后期并隨炎癥時(shí)間延長而表達(dá)增強(qiáng)，在人腎穿標(biāo)本中，系膜增生型腎小球腎炎組織腎小球中TFPI的表達(dá)明顯高于腎小球輕微病變者，提示TFPI可能參與了系膜增生型腎小球腎炎的病理過程。
　　 2.rTFPI可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠

18、MsC發(fā)生凋亡，并具有時(shí)間和劑量依賴性，即使是在MsC大量增殖的環(huán)境中，仍具有該作用；rTFPI誘導(dǎo)MsC發(fā)生凋亡的功能區(qū)主要位于其C末端。
　　 3.rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡與TF起始的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無關(guān)。在rTFPI誘導(dǎo)MsC凋亡的過程中，死亡受體Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，而介導(dǎo)細(xì)胞增殖的PI3K/Akt信號通路活性受到抑制，提示死亡受體Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K/Akt信號通路均是參與rTFPI誘導(dǎo)Ms