蜱傳腦炎病毒診斷抗原的篩選及LI PS檢測技術的優(yōu)化.pdf

1、蜱傳腦炎病毒（Tick-borne encephalitis virus）是黃病毒科黃病毒屬的一種烈性病毒，主要通過蜱蟲叮咬傳播，可引起嚴重的臨床癥狀，威脅人類的健康和社會安定。蜱傳腦炎病毒主要有歐洲型、西伯利亞型和遠東型三種亞型，我國主要為遠東型TBEV，致死率約為20％，因此蜱傳腦炎病毒感染的臨床診斷對疾病的控制和治療有重要意義。TBEV病毒的基因組是由單股正鏈RNA構成的，共編碼三種結構蛋白和七種非結構蛋白，其中的包膜糖蛋白( E

2、蛋白)由496個氨基酸構成，包含了天然病毒90%的抗原中和表位，是TBEV感染的檢測抗原的首選。目前對 TBEV感染血清學檢測的抗原，既有通過病毒培養(yǎng)獲得的全病毒抗原，也有通過體外表達獲得的胞膜糖蛋白片段。
　　本研究表達了含有較多抗原表位的完整E蛋白胞外區(qū)，評價了其在TBEV感染血清檢測中的效果，并優(yōu)化了TBEV感染血清檢測的一種新型的血清學檢測技術-熒光素酶免疫共沉淀（Luciferase immunoprecipitatio

3、n system,LIPS）。熒光素酶免疫共沉淀是將熒光素酶基因與抗原基因共表達，并由真核表達系統(tǒng)制備檢測抗原，通過檢測抗原-抗體-瓊脂糖凝珠混合物中的熒光素酶活性來判斷待檢樣品中的抗體含量。該方法具有檢測靈敏性高、操作簡單快捷等優(yōu)點。
　　本研究的主要內容如下：
　　一、TBEV包膜糖蛋白胞外區(qū)密碼子的優(yōu)化、表達及檢測效果評價
　　首先本研究對TBEV包膜糖蛋白（ E蛋白）的抗原結構域進行了分析，選用TBEV-MDJ

4、01株的E蛋白胞外區(qū)（EC）作為TBEV感染血清的檢測抗原，并通過LIPS方法評價其檢測效果。通過對 EC原始基因序列進行真核密碼子優(yōu)化，由基因合成優(yōu)化的胞外區(qū)基因序列（OPT-EC）。將抗原基因與Rluc（Re nilla luc iferase）基因進行融合構建重組質粒，瞬時轉染真核細胞獲得重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC。比較優(yōu)化基因和原始基因的表達量的差異，并將重組抗原用于臨床感染血清樣本

5、的免疫共沉淀檢測（LIPS），以評價抗原的靈敏性和特異性。
　　對獲得的重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC的熒光活性檢測結果顯示，真核密碼子優(yōu)化后的胞外區(qū)基因（Rluc-OPT-EC）的表達量約是原始基因序列Rluc-EC的12倍。將重組抗原Rluc-OPT-EC用于TBEV感染血清的LIPS檢測，OPT-EC的檢測靈敏度可以達到86%以上，其對乙型腦炎病毒（JEV）感染血清、黃熱病毒（YFV）感染血清、流感病毒（AI

6、V）感染血清和正常人血清的檢測特異度高于90%，但是在西尼羅病毒（WNV）感染血清和登革病毒（DENV）感染血清的檢測中存在交叉反應。
　　實驗證明真核密碼子優(yōu)化能夠有效地提高外源蛋白在真核表達系統(tǒng)中的表達量，且優(yōu)化后的E蛋白胞外區(qū)蛋白作為 TBEV感染的檢測抗原，能夠有效地區(qū)分JEV、YFV感染，但是不能區(qū)分于WVN和DV感染。
　　二、新型LIPS檢測技術的建立和優(yōu)化
　　1.構建表達TBEV檢測抗原的穩(wěn)定細胞系<

7、br>　　LIPS檢測中真核表達抗原是通過瞬時轉染的方法制備的，存在實驗時間長、檢測抗原不穩(wěn)定且需重復制備等問題，為了進一步優(yōu)化抗原的制備方法，本研究采用慢病毒質粒共轉染系統(tǒng)，通過將Rluc-VE3和Rluc-OPT-EC融合基因插入慢病毒載體中構建重組質粒，再將重組質粒與包裝質粒共轉染293T細胞獲得慢病毒包裝顆粒。該慢病毒包裝顆粒能夠感染真核細胞，通過感染COS7細胞，慢病毒將自身基因組整合到細胞基因組中，經(jīng)過RFP和嘌呤素酶篩選，

8、由單克隆細胞分裂獲得能夠穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞株，并對細胞株的外源蛋白表達進行驗證，分別對其表達產(chǎn)物進行海腎熒光素酶活性檢測和TBEV感染血清檢測。
　　經(jīng)單克隆篩選獲得的穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞株，細胞株具備表達紅色熒光蛋白和嘌呤素酶抗性，初步說明慢病毒基因組已整合到細胞基因組中，進一步通過檢測海腎熒光素酶和抗原的表達對細胞株進行驗證。實驗結果顯示，穩(wěn)定細胞株的細胞裂解液中，能夠檢測到海腎熒光素酶活性，Rluc-VE3的熒光強度為

9、5.14×106LU，Rluc-OPT-EC的熒光強度為4.29×105LU，Rluc-VE3的表達量高于Rluc-ORT-EC，分析原因可能是由于Rluc-ORT-EC的分子量較大，從而影響其表達量。對穩(wěn)定表達的重組抗原Rluc-VE3進行LIPS檢測，以判斷其是否表達有VE3抗原。結果表明重組抗原Rluc-VE3在19份TBEV感染血清中，檢測出13份陽性，檢測靈敏度為76.47%（**P＜0.01），而在實驗室前期工作中，通過細胞

10、轉染制備的Rluc-VE3的TBEV陽性檢出率79.2%，穩(wěn)定表達抗原的檢出率與該結果相近，說明構建的穩(wěn)定細胞系COS7-Rluc-VE3表達的重組抗原Rluc-VE3可用于TBEV感染血清的LIPS檢測。
　　本研究中構建了能穩(wěn)定表達檢測抗原的細胞系，簡化了抗原制備的方法，降低了實驗成本、操作時間，能夠持續(xù)穩(wěn)定的為TBEV感染血清的檢測提供診斷抗原。
　　2.檢測標記物的優(yōu)化-以更為穩(wěn)定的Nanoluc代替Rluc

11、　　在實驗操作中，研究發(fā)現(xiàn)Renilla luciferase的熱穩(wěn)定性不好，在37℃環(huán)境中，其熒光素酶活性的半衰期只有10min，在以往的實驗中采用的均是室溫孵育，而抗原抗體的最佳結合條件是37℃，在該溫度條件下可縮短抗原抗體的結合時間，從而使檢測更加快速。為了改善Renilla luciferase對環(huán)境溫度的限制，選擇了新型的基因工程改造酶Nano luciferase作為 LIPS檢測中的標記蛋白，Nano luciferase

12、具備分子量小、熒光信號強且?guī)в蠳-末端分泌信號等優(yōu)勢，可使真核表達抗原的制備從原來收集細胞裂解液，改善為收集細胞上清液，減少抗原中的雜蛋白成分，提高檢測靈敏性。將Nanoluc基因與抗原基因共表達，制備重組抗原Nanoluc-VE3，并對該抗原的熒光素酶活性、熱穩(wěn)定性和作為檢測抗原的檢測效果進行實驗。
　　實驗結果表明，成功制備了Nanoluc-VE3重組抗原，從Nanoluc-VE3和Rluc-VE3的熱穩(wěn)定性結果看出，Nano

13、luc-VE3在37℃和室溫條件下，隨時間的延長其熒光強度并沒有明顯變化，說明Nanoluc在37℃和室溫的穩(wěn)定性均良好。對Nanoluc-VE3和Rluc-VE3熒光素酶活性的檢測中，Nanoluc-VE3的熒光強度為7.79×109LU，而Rluc-VE3的熒光強度為6.71×106LU，Nanluc-VE3的熒光信號要明顯高于Rluc-VE3的熒光信號強度。
　　將Nanoluc-VE3作為檢測抗原用于TBEV感染血清的LI

14、PS檢測，對30份TBEV感染血清的檢測中共檢出28份陽性，表明Nanoluc-VE3能夠作為檢測抗原應用于TBEV感染血清的LIPS檢測，在此基礎上，重新構建了能夠穩(wěn)定表達重組抗原Nanluc-VE3的穩(wěn)定細胞株，該細胞株能夠持續(xù)穩(wěn)定的向胞外分泌重組抗原Nanluc-VE3，并將其應用于感染血清的檢測。穩(wěn)定表達的Nanluc-VE3對30份TBEV感染血清的檢測靈敏度為93.33%，該檢測結果高于Rluc-VE3對TBEV感染血清的檢

15、測靈敏度（76.47%），說明 Nanoluc-VE3的檢測信號靈敏度更高，胞外表達的抗原雜蛋白少，檢測精準度更高。對JEV和DV感染血清的檢測特異性為100%，說明通過穩(wěn)定細胞系制備的重組抗原Nanoluc-VE3能夠用于LIPS檢測，因此本部分實驗為LIPS檢測提供新型的熒光蛋白標簽。
　　本研究評價了E蛋白胞外區(qū)作為TBEV感染血清檢測抗原的檢測效果，為TBEV血清學檢測的抗原篩選提供了重要的實驗依據(jù)。并優(yōu)化了用于TBEV血