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1、炎癥是臨床上普遍存在而又非常重要的病理過(guò)程,過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是非常有害的。臨床上目前使用的抗炎藥物主要為甾體類或非甾體類抗炎藥,但這類藥物均存在作用短暫、易反跳,長(zhǎng)期應(yīng)用有肝腎等毒副作用。因此,構(gòu)建新的藥物傳遞系統(tǒng),使藥物在炎癥病灶選擇性濃集,在增強(qiáng)藥效的同時(shí)減少毒副作用,是藥物研究領(lǐng)域需要解決的重要問(wèn)題之一。
七葉皂苷鈉是從中藥娑羅子干燥成熟果實(shí)中提取的三萜皂苷鈉鹽,具有明顯的抗炎消腫活性。注射用七葉皂苷鈉目前已在臨床上
2、廣泛用于各種疾病的的抗炎消腫,但其靜脈給藥對(duì)血管刺激性強(qiáng),靜注可引起注射部位疼痛,長(zhǎng)時(shí)間用藥可能引起靜脈炎。這些弊端極大地限制了其血管內(nèi)給藥的治療,即限制了其在腦水腫、肺水腫等深部器官炎性疾病中的運(yùn)用。更為重要的是,注射用七葉皂苷鈉靜注后會(huì)發(fā)揮全身作用,病灶部位特異性差。因此,開(kāi)發(fā)出一種新的療效好,順應(yīng)性強(qiáng)的七葉皂苷鈉制劑成為患者及醫(yī)務(wù)工作者的迫切要求。近年來(lái),靶向給藥系統(tǒng)因其安全性及順應(yīng)性好,療效顯著等優(yōu)勢(shì),成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。N
3、-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽(fMLP)是最早發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞趨化性肽,最新研究提出fMP具有強(qiáng)大的白細(xì)胞趨化活性,它通過(guò)與靶細(xì)胞表面的甲酰肽受體(FPR)結(jié)合可高效激活吞噬細(xì)胞,誘導(dǎo)機(jī)體的趨化反應(yīng)、細(xì)胞脫顆粒以及失敏反應(yīng)等,對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和天然免疫起著重要作用?;谘装Y時(shí)白細(xì)胞增多的特點(diǎn),本文在脂質(zhì)體成分之一的膽固醇上共價(jià)修飾fMLP,構(gòu)建了fMLP修飾的脂質(zhì)體,并對(duì)所構(gòu)建的脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行了體內(nèi)外的
4、評(píng)價(jià),同時(shí)對(duì)fMLP修飾脂質(zhì)體的入胞機(jī)制進(jìn)行了初步的探索,為增強(qiáng)炎癥病灶傳遞提供了新的策略。
本文第一部分設(shè)計(jì)并構(gòu)建了白細(xì)胞趨化性肽fMLP修飾的脂質(zhì)體,擬用于提高脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力。本文將fMLP以NH2-PEG2000-Mal作為橋聯(lián)與脂質(zhì)體材料之一的膽固醇共價(jià)結(jié)合,并采用工藝穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)單的薄膜分散法制備fMLP修飾的脂質(zhì)體(fMLP-LIP)。綜合脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的親和力、血清穩(wěn)定性等因素,確定fMLP的用量占脂質(zhì)
5、體總脂質(zhì)摩爾數(shù)的3%,保護(hù)性聚乙二醇(PEG)占2%。以所篩選出的制備工藝及處方制備的fMLP-LIP粒徑在200nm以下。
第二部分制備了香豆素-6標(biāo)記的fMLP修飾的脂質(zhì)體(fMLP-LIP)以及兩組對(duì)照組:普通脂質(zhì)體(LIP)和長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(LLIP),各組脂質(zhì)體粒徑均小于200nm。通過(guò)對(duì)三種不同脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn),不含PEG的LIP組在血清中較不穩(wěn)定,與含血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)混合后透光率降低較為明
6、顯;而其他兩組脂質(zhì)體沒(méi)有顯著的變化。為了更為直觀地評(píng)價(jià)各組脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力,本章對(duì)香豆素-6標(biāo)記的脂質(zhì)體進(jìn)行了體外細(xì)胞攝取的考察。巨噬細(xì)胞表面已被證明表達(dá)有甲酰肽的受體,是體外研究甲酰肽的極好模型。但由于巨噬細(xì)胞屬于不繁殖細(xì)胞,本文用0.1μg/ml的佛波醇酯(PMA)刺激分化U937細(xì)胞為巨噬樣細(xì)胞作為體外研究對(duì)象,考察了細(xì)胞對(duì)各組脂質(zhì)體的攝取能力。結(jié)果表明,分化后的U937細(xì)胞對(duì)fMLP-LIP的攝取明顯高于LIP和LLI
7、P組。同時(shí)進(jìn)一步通過(guò)分化后的U937細(xì)胞對(duì)fMLP-LIP在低溫條件下的攝取顯著降低(P<0.01),表明其入胞過(guò)程依賴于能量。游離的fMLP對(duì)其細(xì)胞攝取也表現(xiàn)出了顯著性的抑制,其是否通過(guò)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
第三部分主要對(duì)fMLP-LIP向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行了體內(nèi)評(píng)價(jià)。本部分選用近紅外染料DIR作為熒光探針標(biāo)記脂質(zhì)體,對(duì)不同脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行定性的體內(nèi)評(píng)價(jià)。通過(guò)小鼠活體及離體組織熒光成像可以觀察到
8、,fMLP的引入大大增加了脂質(zhì)體在炎癥病灶的蓄積。同時(shí),fMLP-LIP在肝、脾、腎等臟器也有一定的分布。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,fMLP的引入能夠增加脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞,但并沒(méi)有減少其在肝、腎等臟器的分布。
第四部分將已經(jīng)構(gòu)建的fMLP-LIP用于抗炎藥物β-七葉皂苷鈉的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。本部分首先對(duì)載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體的處方及制備工藝進(jìn)行考察,確定載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散—超聲法,固定膽固醇與磷脂的比例為1
9、∶2(摩爾比),藥質(zhì)比為1∶3(質(zhì)量比),載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體包封率均大于80%,粒徑均勻,且小于200nm。接著考察了三種載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體對(duì)小鼠表面急性炎癥及深部器官炎癥的治療效果??疾炝似鋵?duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用,對(duì)二甲苯致小鼠毛細(xì)血管通透性增加的拮抗作用以及對(duì)油酸致小鼠肺水腫的抑制作用。結(jié)果表明,fMLP修飾的載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體對(duì)小鼠耳腫脹,毛細(xì)血管通透性增加以及肺重系數(shù)增加的拮抗作用均更為明顯。
第五
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