補(bǔ)陽還五湯對(duì)肺纖維化中誘導(dǎo)免疫損傷的HMGB1的干預(yù)作用研究.pdf

1、肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是以肺實(shí)質(zhì)破壞、纖維斑痕和成纖維細(xì)胞灶形成、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的纖維增殖性疾病。多種間質(zhì)性肺疾病（Interstitial Lung Disease,ILD）在晚期均可發(fā)展為彌漫性肺纖維化，其中特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）最常見。IPF的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏有效治療手段。最近的證據(jù)表明，重要的晚期炎癥因子高遷移率族

2、蛋白B1（HighMobilityGroupBox1protein，HMGB1），能在細(xì)胞核內(nèi)作為α平滑肌動(dòng)蛋白(Alpha-Smooth Muscle Action，α-SMA)基因的轉(zhuǎn)錄活化因子誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），成為肺纖維化成纖維細(xì)胞灶中肌成纖維細(xì)胞的重要來源。在細(xì)胞外能啟動(dòng)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein K

3、inases，MAPKs）、核因子κB（Nuclear Factor kappa B，NF-κB）等多條信號(hào)通路，激活免疫炎癥和異常修復(fù)。根據(jù)IPF的臨床特征和病機(jī)變化特點(diǎn)，在祖國醫(yī)學(xué)中歸屬于“肺痿”、“肺痹”等疾病范疇，病位在肺、腎，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。病因?yàn)橥庑扒忠u、久病傷肺、素體氣虛等，產(chǎn)生痰濁、瘀血、熱毒等病理產(chǎn)物，引起肺腎虧虛、氣虛血瘀、痹阻肺絡(luò)等病機(jī)改變，治療應(yīng)以益氣活血通絡(luò)、祛痰滋陰溫陽為重點(diǎn)。
　　目的：
　　本

4、研究以HMGB1為靶點(diǎn)，以人肺成纖維細(xì)胞（HFL1）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）和博萊霉素致纖維化大鼠為受試對(duì)象，從氣虛血瘀的核心病機(jī)入手，結(jié)合血清藥理學(xué)，采用益氣活血通絡(luò)的“補(bǔ)陽還五湯”在體內(nèi)外共同干預(yù)的方法，探討補(bǔ)陽還五湯治療肺纖維化的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HMGB1刺激HFL1、A549后，細(xì)胞中α-SMA、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（Extracellular Regulate

5、d Protein Kinase1/2，ERK1/2）、NF-κBp65等蛋白表達(dá)的干預(yù)作用
　　首先采用MTT法和ELISA法檢測(cè)0、10、50、100、500ng/ml的HMGB1對(duì)HFL1、A549細(xì)胞增殖和IL-6的影響。根據(jù)結(jié)果選擇最佳濃度的HMGB1作為誘導(dǎo)劑量刺激HFL1、A549細(xì)胞，使用5％、10%、15%、20%不同濃度的補(bǔ)陽還五湯含藥血清進(jìn)行干預(yù)，作用24h后提取細(xì)胞蛋白，通過Western blot方法檢測(cè)

6、補(bǔ)陽還五湯含藥血清在體外對(duì)α-SMA、ERK1/2、NF-κBp65等蛋白表達(dá)的影響。通過ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的變化。
　　2.最佳濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HMBG1刺激HFL1、A549后不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（Signal Transducers and Activators of Transcription3，STAT3）、p-S

7、TAT3等蛋白的影響
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)一選擇最佳濃度的含藥血清，預(yù)刺激HFL1、A549細(xì)胞0.5h后加入HMGB1共同刺激，于0、6、24、72h提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯含藥血清在不同時(shí)間對(duì)α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3等蛋白表達(dá)的影響。
　　3.補(bǔ)陽還五湯對(duì)肺纖維化大鼠肺內(nèi)HMGB1及晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor of Advanced Gly

8、cation End-product，RAGE）的干預(yù)作用
　　采用博萊霉素氣管滴注法復(fù)制肺纖維化模型，在7天、14天、28天分三批采集肺組織。取左肺固定于4%多聚甲醛中，通過HE染色、Masson染色檢測(cè)模型復(fù)制結(jié)果。右肺勻漿，分別提取RNA和蛋白，通過PCR法檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)HMGB1mRNA、RAGE mRNA表達(dá)的影響、Western blot法檢測(cè)HMGB1、α-SMA蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

9、　　1.MTT及ELISA結(jié)果顯示，100ng/ml的HMGB1對(duì)細(xì)胞增殖和IL-6分泌的促進(jìn)作用最明顯，與空白對(duì)照組比較P<0.01。使用不同濃度的補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)HFL1、A549細(xì)胞0.5h，加入100ng/ml的HMGB1作為誘導(dǎo)劑共同刺激24h后，細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示HMGB1可刺激HFL1、A549細(xì)胞中α-SMA表達(dá)增加，與空白對(duì)照組比較P<0.01。補(bǔ)陽還五湯含藥血清可降低兩種細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)，其中20%含

10、藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549細(xì)胞內(nèi)ERK1/2表達(dá)增加，在HFL1中上升趨勢(shì)更明顯。補(bǔ)陽還五湯含藥血清可降低HFL1、A549細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的表達(dá)，20%含藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549細(xì)胞漿和細(xì)胞核中NF-κBp65的表達(dá)增加，其中HFL1細(xì)胞核中NF-κBp65的表達(dá)量高于胞漿，A

11、549細(xì)胞漿中NF-κBp65的表達(dá)量高于胞核。補(bǔ)陽還五湯含藥血清可降低兩種細(xì)胞胞核中NF-κBp65的表達(dá)，在HFL1細(xì)胞中，20%含藥血清與HMGB1刺激組比較P<0.05，在A549細(xì)胞中15%含藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549培養(yǎng)上清中IL-6和IL-1β表達(dá)增加，使用補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)后可降低IL-1β的表達(dá)，增加IL-6的表達(dá)，以20%含藥血清組效果

12、最佳，與HMGB1刺激組比較結(jié)果具有顯著性差異。
　　2.采用HMGB1（100ng/ml）刺激后A549細(xì)胞中α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3表達(dá)升高，與空白對(duì)照組比較P<0.01，p-ERK1/2增高不明顯。α-SMA從0小時(shí)持續(xù)升高至24小時(shí)，ERK1/2在72h達(dá)高峰。使用20%補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)后，可明顯抑制α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)，促進(jìn)p-ERK1/2的表達(dá)，差

13、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　使用HMGB1（100ng/ml）刺激HFL1后，細(xì)胞中α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3表達(dá)均升高，與空白對(duì)照組比較P<0.01。α-SMA、ERK1/2在72小時(shí)升高最明顯，p-ERK1/2從0h持續(xù)增高到72h。使用20%補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)后，可降低α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.

14、采用博萊霉素氣管滴注后，模型組大鼠肺臟出現(xiàn)典型纖維化改變，HE和Masson結(jié)果顯示在7天至28天的時(shí)間中，肺泡炎呈逐漸減輕趨勢(shì)，纖維化呈逐漸增加趨勢(shì)，結(jié)合Szapiel分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷肺纖維化動(dòng)物模型復(fù)制成功。肺纖維化模型組大鼠肺組織中HMGB1mRNA、RAGE mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表達(dá)均增加。HMGB1mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白呈逐漸遞增趨勢(shì)，在第28天達(dá)高峰，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RAGE mRNA呈逐漸

15、下降趨勢(shì)，在第7天達(dá)高峰后持續(xù)下降，但各時(shí)間點(diǎn)與空白組比較均有顯著性差異，P<0.01。使用不同劑量的補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，可不同程度降低HMGB1mRNA、RAGEmRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表達(dá)，以補(bǔ)陽還五湯高劑量組效果最佳，與模型組比較P<0.01。
　　結(jié)論：
　　補(bǔ)陽還五湯可有效抑制纖維化大鼠肺組織中HMGB1、RAGE和α-SMA的表達(dá)并可在體外阻斷HMGB1所激活的多個(gè)與炎癥和纖維化相關(guān)的信號(hào)通路，減輕免疫