miR--200家族在斑馬魚生殖發(fā)育中的功能研究.pdf

1、斑馬魚miR-200家族(miR-200s)有六個(gè)成員:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429a和miR-429b，分布在斑馬魚的6號(hào)和23號(hào)染色體上。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中調(diào)控胚胎的體長(zhǎng)，然而miR-200在成魚中的功能還鮮有報(bào)道。本研究旨在探索miR-200家族在成魚斑馬魚生殖發(fā)育中的功能。通過CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，我們刪除了斑馬魚基

2、因組上miR-200家族的6個(gè)前體。6號(hào)染色體上miR-200家族成員(miR-141、miR-429b和miR-200c)敲除的突變體斑馬魚（下文簡(jiǎn)稱6號(hào)miR-200敲除系，chr6-miR-200-KO）沒有出現(xiàn)任何異于野生型(WT)斑馬魚的表型;23號(hào)染色體上miR-200家族成員(miR-200b、miR-200a和miR-429a)敲除的突變體(下文簡(jiǎn)稱23號(hào)miR-200敲除系，chr23-miR-200-KO)雄魚的精子

3、運(yùn)動(dòng)能力顯著高于WT斑馬魚，同時(shí)23號(hào)miR-200敲除系雌魚不能正常繁殖。
　　在雄魚中，通過解剖觀察WT和突變體的精巢形態(tài)和HE切片的組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩種突變體與WT相比并無(wú)任何異常;而后通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè)了斑馬魚的精子運(yùn)動(dòng)能力，分析結(jié)果顯示6號(hào)miR-200敲除系突變體的精子運(yùn)動(dòng)能力與WT斑馬魚無(wú)顯著性差異，然而23號(hào)miR-200敲除系突變體的精子運(yùn)動(dòng)能力顯著高于WT斑馬魚和6號(hào)miR-200敲除系

4、突變體。通過targetscan軟件在線預(yù)測(cè)與精子生成及精子運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的miR-200的靶基因，我們篩選出了amh、wt1a和srd5a2b三個(gè)候選靶基因，并且在WT和23號(hào)miR-200敲除系突變體中的定量PCR結(jié)果也證實(shí)它們與miR-200的靶向關(guān)系。體外熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的結(jié)果顯示，miR-200a、miR-200b、miR-429a能夠靶向結(jié)合amh、wt1a和srd5a2b的3'UTR。在體內(nèi)，通過在成魚中注射miR-200a

5、、miR-200b、miR-429a穩(wěn)定的模擬物以達(dá)到模擬過表達(dá)miR-200a、miR-200b、miR-429a的目的，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-200a、miR-200b、miR-429a的雄魚的精子運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，同時(shí)精巢中amh、wt1a和srd5a2b的表達(dá)也顯著下調(diào)。之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)p53是miR-200的直接上游，而后我們檢測(cè)了p53突變體中的miR-200a、miR-200b和miR-429a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變體中這三者

6、的表達(dá)量異常低于WT;通過CASA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p53突變體的雄魚精子運(yùn)動(dòng)能力顯著高于WT。WT斑馬魚雄魚的梯度雌二醇浸泡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梯度的雌二醇可以誘導(dǎo)miR-429a梯度上調(diào)表達(dá)和精子運(yùn)動(dòng)能力的下降，同時(shí)p53的表達(dá)顯著上升，然而對(duì)p53突變體進(jìn)行同樣的雌二醇浸泡操作發(fā)現(xiàn)p53突變體的精子運(yùn)動(dòng)能力并沒有受到雌二醇的影響。于是，我們得出以下結(jié)論:雌二醇可通過激活p53途徑直接作用于miR-200a、miR-200b和miR-429a，影

7、響下游靶基因amh、wt1a和srda2b的表達(dá)，導(dǎo)致最終的精子運(yùn)動(dòng)能力受影響。
　　在雌魚中，我們發(fā)現(xiàn)23號(hào)miR-200敲除系突變體不能正常繁殖，而6號(hào)miR-200敲除系突變體的生殖能力與WT斑馬魚無(wú)異。通過對(duì)性成熟的斑馬魚雌魚進(jìn)行解剖及切片的比較觀察，發(fā)現(xiàn)6號(hào)miR-200敲除系和23號(hào)miR-200敲除系突變體與WT的卵巢沒有差異，并且23號(hào)miR-200敲除系突變體和WT一樣，里面各個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞都存在，并無(wú)差異。而

8、后，通過更細(xì)致的觀察，我們發(fā)現(xiàn)23號(hào)miR-200敲除系突變體雌魚和WT的卵細(xì)胞均可正常發(fā)育到Ⅵ期，并且均可在體外誘導(dǎo)達(dá)到最終的卵母細(xì)胞成熟階段。通過hCG的催產(chǎn)挽救，23號(hào)miR-200敲除系突變體可以被部分挽救，并且催產(chǎn)后突變體中的卵細(xì)胞均透明達(dá)到排卵前的階段，但大部分突變體的成熟卵細(xì)胞不能從濾泡細(xì)胞中脫落進(jìn)入卵巢腔，不能人工擠出自由的卵細(xì)胞。促性腺激素的主要成分為L(zhǎng)H和FSH，在斑馬魚中，fshb突變體雌魚沒有出現(xiàn)任何生殖障礙，所

9、以我們鎖定LH在整個(gè)排卵過程中發(fā)揮著非常重要的作用。通過qPCR的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在突變體中l(wèi)hb的表達(dá)明顯低于WT，同時(shí)我們檢測(cè)了在23號(hào)染色體上的miR-200s的靶基因wt1a的表達(dá)，并且驗(yàn)證了lhb的啟動(dòng)子活性可以有效的被Wt1a蛋白抑制。于是我們得出結(jié)論23號(hào)染色體上的miR-200通過調(diào)控下游靶基因wt1a的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控lhb的表達(dá)。那LH又是如何影響斑馬魚的成熟及排卵的呢？我們猜測(cè)這一系列的排卵缺陷是由LH的下降引起下游的孕激素及

10、前列腺素在排卵過程中的不足導(dǎo)致的。于是我們驗(yàn)證這兩個(gè)激素在排卵中的作用。在WT斑馬魚排卵前，DHP在早上5點(diǎn)半左右達(dá)到最高水平，通過注射DHP發(fā)現(xiàn)和hCG挽救結(jié)果一致，23號(hào)miR-200敲除系突變體雌魚可以被部分挽救，這也就證實(shí)了我們的一個(gè)猜想，突變體的生殖障礙有一部分原因是由于LH下調(diào)導(dǎo)致排卵前孕酮供應(yīng)不足導(dǎo)致不能正常成熟及排卵。另一方面，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ptgs2a在排卵前顯著上升，然而前列腺素PGE2和PGF2并不能挽救23號(hào)miR

11、-200敲除系突變體雌魚。與此同時(shí)，我們構(gòu)建了斑馬魚ptgs2a敲除的突變體來確定前列腺素在生殖過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ptgs2a突變體雌魚是可育的，并沒有出現(xiàn)任何排卵障礙。于是我們得出結(jié)論，前列腺素并沒有參與miR-200調(diào)控LH誘導(dǎo)卵細(xì)胞成熟及排卵的這個(gè)過程?？偨Y(jié)23號(hào)染色體上的miR-200成員在雌魚中的作用，我們得出以下結(jié)論:斑馬魚23號(hào)染色體上的miR-200成員miR-200a、miR-200b和miR-429a可以通過靶向