GalNAc-T14多抗的制備、組織表達(dá)及與IGFBP-3共定位研究.pdf

1、N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族是粘蛋白O-糖基化的起始酶，負(fù)責(zé)將供體UDP-GalNAc上的GalNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體蛋白多肽鏈特定序列中的Ser 或Thr 羥基上，從而合成O-聚糖。近年來(lái)有人指出，O-糖基化可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，因此對(duì)該酶家族的研究也受到越來(lái)越多重視。N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶-14（GalNAc-T14）是該家族中截止至目前最新發(fā)現(xiàn)的成員，由于其發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，且對(duì)其研究尚未得以廣泛重視，因此對(duì)GalNAc-

2、T14在癌組織和癌細(xì)胞中的表達(dá)、生物學(xué)特征及功能之間的關(guān)系都需要深入研究。
　　 本論文對(duì)GalNAc-T14基因進(jìn)行了以下三方面的研究：
　　 1．利用生物信息學(xué)方法分析GalNAc-T14蛋白序列，釣取了其Cdna 序列，將該序列亞克隆入Pet-DsbA與His-tag 融合表達(dá)；并且對(duì)誘導(dǎo)及純化條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)免疫新西蘭大耳白兔，獲得多抗血清。利用雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)所制備的多抗效價(jià)，通過(guò)免疫印跡方法鑒定多抗特異性

3、，并檢測(cè)GalNAc-T14在不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明：制備的GalNAc-T14 多克隆抗血清是高特異性的，GalNAc-T14蛋白在乳腺癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞中均有表達(dá)，并推測(cè)如果在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)低表達(dá)GalNAc-T14 則可能顯示腫瘤惡性程度較高，與腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差密切相關(guān)。
　　 2．將GalNAc-T14和IGFBP-3 共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，利用confocAl顯微鏡觀察兩者的共定位情況。結(jié)果表明：GalNAc

4、-T14和IGFBP-3在細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。
　　 3．成功構(gòu)建了GalNAc-T14 昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)載體。將GalNAc-T14 Cdna 序列亞克隆入Pmt/BIP/V5-HIS C 載體，轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞系，為將來(lái)利用昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)獲得GalNAc-T14蛋白，為深入研究GalNAc-T14的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 總之，本論文對(duì)于GalNAc-T14 功能進(jìn)行了初步的研究和探討，將GalNAc-T14與IGFB