緩激肽緩解阿霉素所致豚鼠心室肌細(xì)胞收縮力降低的細(xì)胞學(xué)機制研究.pdf

1、目的：阿霉素作為廣譜抗腫瘤藥物廣泛用于急性白血病、乳腺癌等疾病的治療。不幸的是，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，阿霉素雖可高效作用于疾病患處，但一次大劑量給藥可致心律失常，而長期應(yīng)用則會誘導(dǎo)心肌收縮功能的異常而致心功能衰竭，因此限制了其臨床用量的增加。緩激肽是一種具有心臟保護(hù)作用的九肽物質(zhì)，近期研究表明，緩激肽對心臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但目前并無證據(jù)證明緩激肽對阿霉素所致的心功能損傷是否有保護(hù)作用。為回答此問題，本課題采用急性給藥的方法，觀測在有

2、無緩激肽的情況下，阿霉素對豚鼠心室肌細(xì)胞的長度、肌小節(jié)收縮幅度、細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的影響，并觀察了阿霉素對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位時程和 L-型鈣電流的影響以發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞學(xué)機制。本研究可為緩激肽類制劑能否成為阿霉素致心功能損傷的新型藥物提供重要實驗資料。
　　方法：⑴將豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，用Langendorff灌流裝置急性分離新鮮的豚鼠左心室肌細(xì)胞。⑵將分離好的新鮮心室肌細(xì)胞置于無鈣臺式液中覆上Fluo-2AM鈣熒光染料，黑暗中

3、放置25~30 min。吸出部分細(xì)胞置于動緣檢測系統(tǒng)的凹槽中，在15 V、0.5 Hz持續(xù)、恒定的電壓刺激下穩(wěn)定5~10 min后，分別用含有不同濃度阿霉素（0.1μM,1μM和10μM）的細(xì)胞外液灌流心室肌細(xì)胞，觀察并比較有無緩激肽（1μM）的條件下心室肌細(xì)胞肌小節(jié)收縮幅度以及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的變化，記錄肌小節(jié)的長度、心室肌細(xì)胞的收縮及舒張速率、細(xì)胞內(nèi)收縮期和舒張期的鈣離子濃度變化及鈣瞬變幅度的變化。⑶將分離好的新鮮心室肌細(xì)胞逐級復(fù)鈣至終

4、濃度1.8 mM，在細(xì)胞外液中恒定灌流3~5 min，在電流鉗模式下，對細(xì)胞給予1400 pA電流的閾上刺激，刺激頻率為1 Hz,持續(xù)3 ms，引出動作電位。待圖像穩(wěn)定后，先后給予緩激肽以及不同濃度的阿霉素，觀測心室肌細(xì)胞動作電位時程的改變。進(jìn)而在電壓鉗模式下，觀察并比較有無緩激肽時，阿霉素對心室肌細(xì)胞的L-型鈣電流幅度、激活及失活曲線的影響。⑷實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean± S.D）表示，給藥前后采用配對t檢驗，組間比較采用組間

5、t檢驗，P<0.05為顯著性差異， P<0.01為有極顯著性差異。
　　結(jié)果：①緩激肽對阿霉素致豚鼠心室肌細(xì)胞肌小節(jié)長度及收縮舒張幅度改變的影響。和給藥前相比，阿霉素可濃度依賴性地縮短心室肌細(xì)胞肌小節(jié)長度（P<0.01）。通過對比給藥前后心室肌細(xì)胞的收縮和舒張速率，我們發(fā)現(xiàn)心室肌細(xì)胞最大收縮速率隨著阿霉素濃度的升高而降低（P<0.01），心室肌細(xì)胞最大舒張速率未見明顯改變。而在細(xì)胞外液中預(yù)先加入緩激肽1μM，對阿霉素所致的心室肌細(xì)

6、胞肌小節(jié)縮短以及收縮速率降低有明顯的對抗作用；②緩激肽對阿霉素所致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及鈣瞬變的影響。將心室肌細(xì)胞用Fluo-2AM負(fù)載后繼續(xù)采用無鈣臺式液灌流，觀察在有無緩激肽時，阿霉素對收縮期、舒張期心室肌細(xì)胞鈣離子濃度及鈣瞬變幅值的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素0.1μM,1μM和10μM對心室肌細(xì)胞收縮期鈣離子濃度無明顯影響，而舒張期細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度呈濃度依賴性的升高（P<0.05和P<0.01），鈣瞬變幅度降低（P<0.01）。預(yù)先

7、用緩激肽孵育，可緩解阿霉素所致的心室肌細(xì)胞舒張期鈣離子濃度升高和鈣瞬變幅度降低現(xiàn)象（P<0.05和P<0.01）；③緩激肽對阿霉素所致細(xì)胞動作電位時程變化的影響。對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位影響的試驗結(jié)果表明，阿霉素可以濃度依賴性的縮短動作電位時程（APD50和 APD90，P<0.01）。預(yù)先用緩激肽處理心室肌細(xì)胞可明顯緩解阿霉素所致的APD50和APD90縮短（P均<0.01）；④緩激肽對阿霉素所致細(xì)胞L-型鈣電流變化的影響。對 L-型

8、鈣電流的測定結(jié)果表明，在電壓鉗模式下，將心室肌細(xì)胞鉗制在-40 mV，并去極化至0 mV時，觀察緩激肽預(yù)處理對阿霉素致L-型鈣電流峰值幅度降低的影響。結(jié)果表明，隨著阿霉素濃度的增加，L-型鈣電流峰值幅度呈濃度依賴性降低（P<0.01）。采用10μM的阿霉素繼續(xù)觀察其對L-型鈣電流I-V曲線、激活及失活曲線的影響。結(jié)果表明，10μM阿霉素對L-型鈣電流具有電壓依賴性抑制作用，在-10 mV~+10 mV抑制作用最為明顯（P<0.01），而

9、在-40mV~-20 mV和+40mV~+60mV區(qū)間未見明顯影響。通過觀察心室肌細(xì)胞的激活失活曲線，我們發(fā)現(xiàn)高濃度的阿霉素可以減慢 L-型鈣電流的激活過程，但對失活過程無明顯影響。緩激肽可以有效延緩阿霉素減小 L-型鈣電流的現(xiàn)象，且可使減慢激活的現(xiàn)象得到改善。
　　結(jié)論：⑴阿霉素可濃度依賴性的縮短豚鼠心室肌細(xì)胞肌小節(jié)長度、增大細(xì)胞內(nèi)舒張期的鈣離子濃度、減小鈣瞬變幅度并縮短動作電位時程，減慢 L-型鈣電流的激活而對 L-型鈣電流具