脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　自19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)人體生理電場(chǎng)以來(lái)，從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到在體實(shí)驗(yàn)，人們對(duì)電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用進(jìn)行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，正常皮膚表皮或上皮組織細(xì)胞間能夠維持定向的離子流動(dòng)，從而形成縱向電位差;當(dāng)皮膚或上皮組織的完整性受到破壞、形成創(chuàng)面時(shí)，該電位差在創(chuàng)面處迅速短路，使電流從正常組織區(qū)域流向創(chuàng)面，形成電場(chǎng)方向指向創(chuàng)面的橫向電場(chǎng)，這即是創(chuàng)面內(nèi)源性電場(chǎng)。近年研究顯示，創(chuàng)面內(nèi)源性電場(chǎng)是指導(dǎo)表皮細(xì)胞定向遷移的關(guān)鍵因素，而后者

2、是創(chuàng)面愈合的前題基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞能在外加持續(xù)直流電場(chǎng)下產(chǎn)生定向遷移，該現(xiàn)象稱為表皮細(xì)胞的電趨性。目前，國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究均采用持續(xù)直流電場(chǎng)作為刺激因素研究細(xì)胞的電趨性及其機(jī)制。然而，持續(xù)直流電場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間作用將不可避免導(dǎo)致熱效應(yīng)和電解效應(yīng)等電刺激副作用，使得持續(xù)直流電場(chǎng)的在體應(yīng)用受到限制、現(xiàn)有研究與臨床應(yīng)用脫軌。我們前期發(fā)現(xiàn)，處于持續(xù)直流電場(chǎng)環(huán)境中的成纖維細(xì)胞去掉電場(chǎng)作用后，其電趨性并不會(huì)立即消失，而在一定時(shí)間內(nèi)仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的定向遷

3、移特性，提示細(xì)胞的電趨性誘導(dǎo)或維持并不需要持續(xù)的電刺激，進(jìn)而我們推測(cè)脈沖直流電可能同樣具有誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的作用。
　　脈沖直流電場(chǎng)(PDCEF)是一種間斷作用的直流電場(chǎng)，具有場(chǎng)強(qiáng)(EF)、頻率(f)和脈寬(D)三個(gè)可變參數(shù)。與持續(xù)直流電場(chǎng)(CDCEF)相比，PDCEF能通過(guò)調(diào)節(jié)脈寬進(jìn)而調(diào)節(jié)電場(chǎng)的作用時(shí)間;若低脈寬的脈沖直流電能誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性，那么無(wú)疑將顯著減少電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間，減輕電場(chǎng)的熱效應(yīng)和電解效應(yīng)，從而有可能為臨床應(yīng)用電

4、場(chǎng)促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供新的技術(shù)方法。本研究旨在探討不同參數(shù)條件下PDCEF對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的誘導(dǎo)作用;通過(guò)與相同場(chǎng)強(qiáng)的CDCEF比較，評(píng)估PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的效能與副作用，為臨床應(yīng)用PDCEF促進(jìn)創(chuàng)面愈合奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　1、乳鼠原代表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>　　取出生1-3天的Balb/c乳鼠全層皮膚，用DispaseⅡ溶液4℃孵育過(guò)夜;次日分離表皮，將其剪碎后用0.2

5、5％胰酶消化約5min，血清終止消化，反復(fù)吹打后過(guò)濾、離心;調(diào)整細(xì)胞密度至1×103后將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)待用。
　　將構(gòu)建的電趨性小室模型浸泡于75％的酒精中30min，然后置于超凈臺(tái)紫外燈下照射30min。將接種有表皮細(xì)胞的細(xì)胞爬片置入電趨性小室，在電趨性小室兩側(cè)加細(xì)胞培養(yǎng)基各2ml，使電趨性小室中充滿培養(yǎng)基;常規(guī)構(gòu)筑外加電場(chǎng)裝置，將構(gòu)建好的細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭糜诨罴?xì)胞工作站，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞

6、在電場(chǎng)作用下的遷移運(yùn)動(dòng)。
　　2、脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用和特性分析
　　1)選取一定參數(shù)的PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用表皮細(xì)胞3h，Image J軟件分析表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性和速度，明確PDCEF是否具有表皮細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)作用。
　　2)固定PDCEF頻率為0.1Hz、脈寬為60％，觀察場(chǎng)強(qiáng)變化(0-200mV/mm)對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的影響。
　　3)固定PD

7、CEF頻率為0.1Hz、場(chǎng)強(qiáng)為150 mV/mm，觀察脈寬變化(0-100％)對(duì)表皮細(xì)胞電趨性的影響。由于脈寬為100％的PDCEF實(shí)質(zhì)上為CDCEF，因此上述實(shí)驗(yàn)可用于對(duì)比分析相同場(chǎng)強(qiáng)作用條件下PDCEF和CDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。
　　4)固定PDCEF場(chǎng)強(qiáng)為150 mV/mm、脈寬為60％，觀察頻率(0.001-5000000Hz)變化對(duì)細(xì)胞電趨性的影響。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和介導(dǎo)電

8、化學(xué)副反應(yīng)的對(duì)比研究
　　1)在場(chǎng)強(qiáng)(50-250 mV/mm)相同的條件下，對(duì)比分析不同脈寬(20-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）和CDCEF（脈寬為100％的PDCEF）誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。
　　2)分析在場(chǎng)強(qiáng)(50-250 mV/mm)相同的條件下，當(dāng)不同脈寬(40-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）實(shí)際作用于細(xì)胞的電刺激時(shí)間與CDCEF相同時(shí)表皮細(xì)胞電趨性差異。
　　3)在相同場(chǎng)強(qiáng)(EF=

9、150mV/mm)作用條件下，對(duì)比分析PDCEF和CDCEF對(duì)電趨性模型中溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基pH值和mV值變化的影響，明確PDCEF和CDCEF介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)差異。
　　結(jié)果:
　　1、乳鼠原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?br>　　原代小鼠表皮細(xì)胞接種培養(yǎng)4h左右開始貼壁、伸展，細(xì)胞輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，可見偽足伸展，折光性好，生長(zhǎng)旺盛。構(gòu)建的電趨性實(shí)驗(yàn)裝置可用于活細(xì)胞工作站下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng);電場(chǎng)持

10、續(xù)作用3h，電趨性小室兩側(cè)電壓波動(dòng)小，表明實(shí)驗(yàn)裝置具有良好的穩(wěn)定性。
　　2、脈沖直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性分析
　　1)在3h的觀察時(shí)間內(nèi)，無(wú)電場(chǎng)作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)隨機(jī)運(yùn)動(dòng)(方向性:-0.09±0.05);而PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的向電場(chǎng)陰極遷移運(yùn)動(dòng)（方向性:0.76±0.04），同時(shí)在X軸方向上的運(yùn)動(dòng)速度顯著增高。時(shí)效分析顯示，施加PDCEF30分鐘內(nèi)

11、，表皮細(xì)胞即表現(xiàn)出向電場(chǎng)陰極定向遷移的特性，且運(yùn)動(dòng)速度增加。
　　2)在固定頻率(0.1Hz)和脈寬(60％)的條件下，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與場(chǎng)強(qiáng)呈正相關(guān);場(chǎng)強(qiáng)越高，表皮細(xì)胞的電趨性越好，表現(xiàn)為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性和速度增加。場(chǎng)強(qiáng)為50 mV/mm時(shí)，表皮細(xì)胞向電場(chǎng)陰極遷移的方向性為0.35±0.05，提示該條件下PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值電壓在50 mV/mm以下。
　　3)在固定頻率(0.1Hz)和場(chǎng)強(qiáng)

12、(150 mV/mm)的條件下，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與脈寬呈正相關(guān);脈寬越大，表皮細(xì)胞的電趨性越好。脈寬為20％時(shí)，表皮細(xì)胞向電場(chǎng)陰極遷移的方向性為0.26±0.05，提示該條件下PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值脈寬為20％左右。當(dāng)脈寬達(dá)到或大于60％時(shí)，表皮細(xì)胞向陰極遷移的方向性增加不再顯著，與100％的脈寬（實(shí)質(zhì)為持續(xù)直流電場(chǎng)）比較無(wú)顯著差異。
　　4)在固定場(chǎng)強(qiáng)(150 mV/mm)和脈寬(60％)的條件下，

13、0.001-1000Hz之內(nèi)的頻率變化對(duì)PDCEF誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞電趨性無(wú)顯著影響;當(dāng)頻率達(dá)到5000000Hz時(shí)，表皮細(xì)胞的電趨性顯著下降。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場(chǎng)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和電化學(xué)副反應(yīng)的對(duì)比研究
　　1)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下，達(dá)到一定閾值脈寬的PDCEF（頻率為0.1Hz）均能誘導(dǎo)與CDCEF等效的電趨性。場(chǎng)強(qiáng)為50 mV/mm時(shí)，PDCEF達(dá)到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為80％;場(chǎng)強(qiáng)為150 mV/mm

14、時(shí)，PDCEF達(dá)到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為60％;場(chǎng)強(qiáng)為250 mV/mm時(shí)，PDCEF達(dá)到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為40％。
　　2)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下，當(dāng)PDCEF（頻率為0.1Hz）實(shí)際作用于細(xì)胞的電刺激時(shí)間與CDCEF相同時(shí)，PDCEF較之CDCEF能以更短的實(shí)際電刺激時(shí)間誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性。場(chǎng)強(qiáng)為50、150和250mV/mm時(shí)，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞出現(xiàn)電趨性的時(shí)間分別為30min、15min和15m

15、in;而CDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性出現(xiàn)的時(shí)間分別為45min，45min和30min，提示間斷電刺激能增強(qiáng)表皮細(xì)胞的電趨性反應(yīng)。
　　3)在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下，PDCEF所導(dǎo)致的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液pH和mV值改變顯著小于CDCEF，且隨時(shí)間的增加，這一趨勢(shì)越明顯。
　　結(jié)論:
　　1、PDCEF具有誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的重要作用，其電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)呈場(chǎng)強(qiáng)、作用時(shí)間、脈寬和頻率依賴性。
　　2、在場(chǎng)強(qiáng)相同的條件下，達(dá)到