PARP-1抑制劑抗芥子氣損傷的作用及機制研究.pdf

1、芥子氣（Sulfur mustard，SM）是一種糜爛性化學戰(zhàn)劑，曾在第一次、第二次世界大戰(zhàn)及兩伊戰(zhàn)爭中廣泛使用，由于其使用最多、最為普遍和傷害較大，被稱為“毒劑之王”。二戰(zhàn)后，日本遺留在中國的化學戰(zhàn)劑以SM為主，時有造成我平民傷害的報道。SM結(jié)構(gòu)簡單，容易合成，易被恐怖分子掌握和利用。美國疾病控制與預防中心2000年4月發(fā)表的關于“生化恐怖戰(zhàn)備計劃”的建議中指出，恐怖分子可能使用的毒劑包括化學戰(zhàn)劑和一般的工業(yè)毒性化合物，但最有可能使用

2、的仍然是神經(jīng)性毒劑、糜爛性毒劑和氰類毒劑。皮膚、眼及呼吸系統(tǒng)是 SM局部中毒的主要靶器官，而骨髓、造血、免疫系統(tǒng)等是SM全身中毒的主要靶器官。SM損傷的作用機理復雜，至今尚未完全闡明，且無理想的防治藥物。因此，研制作用更強、療效更好的新型SM防治藥物是亟待解決的主要問題之一。
　　SM是一種雙功能烷化劑，主要與細胞中的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等生物大分子發(fā)生反應。嚴重的DNA損傷是SM導致細胞死亡的主要原因。SM導

3、致DNA損傷后，許多生化途徑被激活用于保護細胞免于死亡。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的DNA損傷修復酶。當SM造成DNA損傷后，PARP-1被迅速激活，PARP-1通過消耗NAD+合成大量的聚腺苷二磷酸核糖(poly(ADP-ribose), pADPr)，

4、而pADPr會共價結(jié)合于PARP-1本身或其他 DNA損傷修復相關的核蛋白，從而介導 DNA損傷修復。然而，當 PARP-1過度激活時則會大量消耗細胞內(nèi)NAD+，造成能量耗竭甚至細胞死亡。提示PARP-1的激活在SM損傷中有十分重要的作用。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑能夠一定程度上的減輕SM造成的病理損傷，表明其在 SM損傷中有一定的治療作用。美軍研究表明 PARP-1抑制劑能夠減輕SM造成的小鼠皮膚病理損傷50％以上

5、，提示PARP-1抑制劑有望用于防治SM中毒。但也有研究表明，雖然PARP-1抑制劑能夠避免SM損傷造成的NAD+耗竭，但是對細胞存活并沒有明顯的保護作用。而且有研究表明，PARP-1抑制劑能夠減慢SM損傷后DNA的損傷修復速度。因此PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效以及PARP-1在SM損傷中的作用機制并不明確，有待進一步研究和確證。
　　課題組首先合成了美軍正在研究并可能用于防治SM中毒的新型PARP-1抑制劑；另外，目前在腫

6、瘤治療的研究中，出現(xiàn)了新的一批活性及選擇性更強的PARP-1抑制劑，這些新的藥物抗 SM損傷的作用效果值得期待。接下來我們對以上化合物進行了體外分子水平的PARP-1抑制活性篩選，然后選擇其中活性較強的化合物在細胞水平及動物水平進行了系統(tǒng)的藥效學評價，并對其作用機制進行了探討。
　　一、PARP-1抑制劑的活性篩選及其抗SM損傷的活性評價
　　首先對化學合成獲得的BPUBA、S001、S002、S003等85個化合物進行了體

7、外分子水平的PARP-1抑制活性篩選，進而選擇其中活性較強的化合物在細胞水平及動物水平進行了其抗SM損傷活性的評價。
　　1.體外篩選PARP-1抑制劑的活性
　　Trevigen's Homogeneous PARP Inhibition Assay是一個利用熒光的高靈敏體外篩選PARP-1抑制劑的系統(tǒng)，本部分利用此試劑盒篩選化合物對PARP-1的抑制活性。
　　結(jié)果顯示，S001和S003及其類似物的PARP-1抑

8、制活性較高，而BPUBA、S002及其類似物對 PARP-1的抑制活性較低，提示后續(xù)研究可重點開展活性較高的S001和S003及其類似物抗SM皮膚損傷的藥效學試驗。
　　2.體外細胞水平的藥效評價
　　體外篩選結(jié)果表明，PARP-1抑制劑S001、S003及其類似物對PARP-1有較強的抑制活性，因此后續(xù)研究應用SM損傷的永生化人表皮角化形成細胞（HaCaT）模型，對這兩個化合物及其類似物對 SM損傷細胞的保護作用進行了體外

9、藥效學評價。
　　應用1000μM SM染毒6h和24h后，HaCaT細胞活力均顯著性降低，且隨著染毒時間增加，細胞活力降低更加明顯。S001、S003及其類似物干預后，在染毒后6h，能明顯增加細胞活力；而在染毒后24h，S001、S003等化合物雖然仍然能夠增加 SM染毒組的細胞活力，但是這種作用已逐漸降低。結(jié)果表明，以上化合物能夠顯著減輕SM導致的細胞死亡，且在染毒后6h時的保護作用明顯優(yōu)于24h。
　　3.整體動物水平

10、的藥效評價
　　應用0.64mg/ear SM染毒，首先建立了小鼠耳廓SM皮膚損傷模型，繼而應用此模型對PARP-1抑制劑進行了整體動物水平的藥效評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.64mg/ear SM染毒后小鼠耳廓水腫程度顯著性增加，PARP-1抑制劑S003腹腔注射能夠顯著性降低0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫，但是給藥方式改為口服或涂抹給藥時，對0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫則沒有明顯的減輕作用。結(jié)果表明

11、，S003給藥方式為腹腔注射時效果較好，但是給藥方式改為口服及涂抹時藥效不明顯。此外，我們應用 SM染毒建立了無毛豚鼠 SM皮膚染毒模型，并觀察了PARP-1抑制劑S003的藥效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SM可以使皮膚紅腫和皮膚血流顯著性增加，腹腔注射給予PARP-1抑制劑S003后能顯著性降低SM造成的皮膚紅腫和皮膚血流增加。
　　二、PARP-1抑制劑在SM損傷中的作用及機制研究
　　綜合體外活性篩選和體內(nèi)外的藥效評價結(jié)果，確定了藥效

12、最好的PARP-1抑制劑S003，繼而在HaCaT細胞染毒模型上對其抗SM損傷的作用及其機理進行研究，并探討了PARP-1抑制劑在SM損傷防治中的應用價值。
　　1. PARP-1抑制劑S003對SM所致PARP-1激活的抑制作用
　　應用熒光的高靈敏體外篩選 PARP-1抑制劑的試劑盒，檢測了活性最強的PARP-1抑制劑S003及經(jīng)典的PARP-1抑制劑3-AB對PARP-1的IC50值，評價了其對PARP-1的抑制作用。

13、結(jié)果表明，PARP-1抑制劑S003（IC50=60.22nM）抑制PARP-1的能力比3-AB（IC50=10.86μM）強180倍以上。
　　采用免疫熒光法及Western Blot方法，于100μM及1000μM SM染毒后立即給予S003，觀察SM染毒HaCaT細胞損傷模型PARP-1的活化及S003對PARP-1活化的抑制作用。結(jié)果顯示，100μM和1000μM SM染毒6h后，HaCaT細胞內(nèi)PARP-1活化產(chǎn)物pAD

14、Pr的表達均明顯增加，1000μM SM誘導PARP-1的活化程度明顯高于100μM SM。SM染毒后立即應用S003可顯著降低HaCaT細胞中pADPr的表達，在1000μM SM染毒時效果最為明顯。結(jié)果提示，SM損傷可導致PARP-1活化，給予S003可以顯著抑制PARP-1的激活，提示S003是一個有效的PARP-1抑制劑。
　　2. PARP-1抑制劑S003對SM所致HaCaT細胞及小鼠耳廓皮膚損傷的作用
　　在H

15、aCaT細胞SM染毒模型上，觀察了SM不同染毒濃度（100μM及1000μM）染毒6h和24h后S003對細胞活力的作用。結(jié)果顯示100μM及1000μM SM可以使細胞活力顯著性降低。在染毒后6 h，給予S003顯著增加了1000μM SM染毒組的細胞活力，而對100μM SM染毒組沒有觀察到藥效。然而在染毒后24h，不論在100μM SM還是1000μM SM染毒條件下，均沒有觀察到S003保護細胞活力的作用。
　　在小鼠耳廓

16、SM染毒模型上，觀察了SM不同染毒濃度（0.16mg/ear，0.64mg/ear）染毒24h后，S003對小鼠相對耳腫程度（REW）及表皮壞死（EN）的作用。結(jié)果表明，高濃度SM染毒組（0.64mg/ear）的評分（REW204.83, EN3.9）顯著性高于低濃度SM染毒組（0.16mg/ear）的評分（REW154.67, EN2.2）。給予PARP-1抑制劑S003后，顯著性降低了高濃度SM染毒組的REW評分（26%）及EN評分

17、（40%），而對低濃度SM染毒組的評分沒有顯著性影響。采用H&E染色方法觀察SM對小鼠耳廓皮膚的損害。結(jié)果顯示，暴露于0.16mg/ear及0.64mg/ear SM后24h均會造成小鼠耳廓皮膚中度到重度的病理學改變，主要表現(xiàn)為真皮炎癥細胞浸潤、網(wǎng)狀變性及表皮基底細胞壞死，伴隨高嗜酸性粒細胞的細胞質(zhì)及細胞核固縮。給予 S00324h后對0.64mg/ear SM造成的細胞核固縮有明顯的保護作用，而對0.16mg/ear SM造成的損傷沒

18、有明顯作用。
　　上述結(jié)果提示，PARP-1抑制劑S003在HaCaT細胞及小鼠耳廓模型上對SM損傷有一定保護作用。
　　3. PARP-1抑制劑S003對SM所致NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死的影響
　　國際上已有體內(nèi)外的實驗證明，SM染毒可以造成PARP-1的過度激活及NAD+含量的降低。我們對本研究中應用的HaCaT細胞染毒模型上SM對NAD+/ATP的影響進行了驗證并考察了S003的藥效。結(jié)果提示，SM染毒會濃

19、度依賴性地降低細胞內(nèi)NAD+/ATP含量，而染毒后立即給予S003后對SM造成的NAD+/ATP含量降低有保護作用。
　　此外，SM介導的PARP-1的活化可能會造成細胞壞死或凋亡。因此，通過Annexin V/PI雙染實驗觀察了SM對細胞凋亡和壞死的影響并評價S003的作用。結(jié)果表明，SM能造成明顯的細胞凋亡和壞死，給予S003可顯著降低凋亡和壞死的細胞數(shù)目。
　　在接下來的實驗中，我們繼續(xù)研究了S003對凋亡執(zhí)行蛋白Ca

20、spase3活力的影響，以及S003對重要的凋亡信號也就是Caspase3切割PARP-1的產(chǎn)物c-PARP表達的影響。結(jié)果顯示，染毒后6h，隨著SM濃度的增加，Caspase3的活性及c-PARP的表達也顯著增加，而染毒后立即給予S003會顯著性降低高濃度SM（1000μM SM）染毒造成Caspase3的激活及c-PARP的表達，而對低濃度SM染毒（100μM SM）造成的Caspase3的激活及 c-PARP的表達沒有顯著性降低作

21、用；染毒后24h， Caspase3的活性及c-PARP的表達亦顯著性增加，S003能夠顯著性降低100μM及1000μM SM造成Caspase3激活，而對c-PARP沒有明顯的作用。
　　上述結(jié)果提示，PARP-1抑制劑S003對高濃度SM染毒細胞具有保護作用，主要原因可能在于減輕了SM染毒造成的嚴重的NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死。S003對低濃度SM所致的細胞損傷沒有保護作用，原因可能在于低濃度SM染毒對細胞損傷較輕，NA

22、D+/ATP消耗及凋亡壞死程度較輕。
　　4. PARP-1抑制劑S003對SM所致DNA損傷的影響
　　當DNA發(fā)生斷裂，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSBs）的敏感標志物H2AX會在其Ser139位形成磷酸化，H2AX磷酸化的程度與DNA損傷程度密切相關。我們應用流式細胞儀檢測HaCaT細胞中H2AX在Ser139位的磷酸化程度，研究SM對DNA損傷的影響及S003的作用。結(jié)果表明

23、，染毒后6h和24h SM會顯著性增加H2AX的磷酸化。而S003在染毒后6h對H2AX的磷酸化沒有明顯作用，在染毒后24h進一步增加了SM造成的H2AX磷酸化。這一結(jié)果表明PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。
　　三、PARP-1敲降對SM損傷后HaCaT細胞的影響
　　采用RNA干擾的方法，敲降HaCaT細胞中的PARP-1，深入研究PARP-1在SM損傷中的作用，具體結(jié)果如下。
　　1. PAR

24、P-1敲降效率的確定及對SM損傷后HaCaT細胞活力的影響
　　通過檢測RNA干擾后，HaCaT細胞中PARP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白含量，確定PARP-1在HaCaT細胞上的敲降效率。結(jié)果表明，PARP-1敲降效率較高，能夠進行后續(xù)實驗。通過檢測PARP-1敲降對SM染毒后HaCaT細胞活力的影響，研究PARP-1敲降對SM所致細胞毒性的作用。結(jié)果表明，PARP-1敲降能夠增加細胞活力，減輕SM所致的細胞毒性。
　　2

25、. PARP-1敲降對SM損傷后HaCaT細胞凋亡通路的影響
　　通過檢測內(nèi)源性凋亡途徑的信號p-JNK、p-p53、Caspase9、外源性凋亡途徑的信號Caspase8、凋亡蛋白c-PARP的生成和Caspase3的激活，研究SM染毒后細胞凋亡情況及PARP-1敲降對SM損傷后HaCaT細胞凋亡通路的影響。結(jié)果表明，PARP-1敲降能夠降低SM染毒后HaCaT細胞的凋亡，可能是通過降低內(nèi)源性和外源性凋亡途徑信號及凋亡蛋白的激活

26、來發(fā)揮作用。
　　3. PARP-1敲降對SM損傷后HaCaT細胞Akt/mTOR通路的影響
　　PARP-1可通過影響自噬抑制因子mTOR來參與自噬調(diào)節(jié)。為了研究SM染毒后是否對 Akt/mTOR通路有影響以及 PARP-1如何參與到這個過程中，我們在PARP-1敲降及對照的HaCaT細胞上檢測了Akt及mTOR的磷酸化。提示PARP-1下調(diào)可能通過Akt/mTOR通路的重新激活來抑制自噬。
　　上述結(jié)果提示PARP

27、-1敲降能顯著性的增加SM染毒后HaCaT細胞的細胞活力，降低p-JNK、p-p53、Caspase9、Caspase8、c-PARP、Caspase3的激活和Annexin V的染色，進一步證明了降低 PARP-1可以通過下調(diào)多個凋亡通路的檢查點來抑制SM造成的凋亡。另外，PARP-1敲降還能夠逆轉(zhuǎn)SM染毒導致的Akt/mTOR通路的抑制，從而可能通過Akt/mTOR的激活來抑制自噬。
　　通過以上研究，本論文主要得出以下結(jié)論：

28、
　　1. S003是一種強效的PARP-1抑制劑，其在體外對PARP-1的抑制活性是經(jīng)典的PARP-1抑制劑3-AB的180倍。
　　2. PARP-1抑制劑S003對SM染毒細胞模型和動物模型均有明顯的保護作用。S003對高濃度SM染毒造成的HaCaT細胞活力降低有明顯的保護作用；S003對高濃度 SM造成的小鼠耳廓水腫及病理改變有明顯改善作用，對高濃度SM造成的無毛豚鼠皮膚紅腫和皮膚血流增加有明顯的降低作用。
　

29、　3. PARP-1抑制劑S003抗SM損傷的作用主要可能在于改善SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭及降低凋亡和壞死。
　　4. PARP-1敲降可減輕SM損傷，而調(diào)節(jié)細胞凋亡及自噬相關通路可能是其發(fā)揮保護作用的重要途徑。
　　5. PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。
　　6.通過進一步研究，S003有望發(fā)展為防治SM中毒的新型藥物。
　　總之，本研究首先經(jīng)過體內(nèi)外藥效學評價，篩選出了活性最好

30、的強效PARP-1抑制劑 S003，進而采用 PARP-1抑制劑 S003給藥以及 PARP-1敲降的方法，對PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效及作用機理進行了研究。結(jié)果提示，PARP-1抑制劑對高濃度SM小鼠耳廓染毒模型，無毛豚鼠皮膚染毒模型及HaCaT細胞模型均有明顯的保護作用。下調(diào)PARP-1抗SM損傷的作用機理主要為減輕SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭，降低細胞凋亡壞死及自噬。然而，PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的D