預知子提取物的質量控制及其抗抑郁藥效-藥動學研究.pdf

1、目的:提取分離藥材預知子(Fructus Akebiae)中抗抑郁活性成分,測定預知子提取物(Fructus Akebiae Extract,FAE)主要成分常春藤皂苷元(hederagenin),齊墩果酸(Oleanolic acid,OA),熊果酸(Ursolic acid,UA)含量,對預知子提取物的溶劑殘留及重金屬進行檢測,初步研究FAE質量控制的標準。建立檢測大鼠血漿及腦脊液中常春藤皂苷元的超快速液相色譜-質譜聯(lián)用(UFLC-

2、MS/MS)方法,初步闡明預知子中抗抑郁活性成分常春藤皂苷元的藥代動力學。建立抑郁相關的行為絕望模型,對預知子提取物及常春藤皂苷元抗抑郁活性的藥效學篩選,明確預知子中抗抑郁活性的物質基礎。
　　 方法:(1)藥材預知子中抗抑郁活性成分提取:以預知子藥材為原料,先進行脫脂處理,再依次進行80％乙醇、乙酸乙酯和水飽和正丁醇提取后得預知子總皂苷,將所得總皂苷經含酸乙醇降解及純化處理后得預知子提取物(FAE)。并采用UFLC-MS/MS

3、法,對FAE中的主要化學成分進行系統(tǒng)解析,測定其主要成分常春藤皂苷元,齊墩果酸,熊果酸含量。(2)FAE中有機溶劑的殘留量檢測:采用自動頂空GC-MS法,用RxiTM-5ms(30m×0.25mm,0.25μm)毛細管色譜柱,優(yōu)化頂空條件,以叔丁醇為內標。參照中國藥典(2010年)中的相關規(guī)定,測定了預知子提取過程中使用的三種有機溶劑.乙醇、乙酸乙酯、正丁醇的殘留量(3)預知子藥材及FAE中5種有害重金屬的測定:微波消解,以鍺(Ge)、

4、銦(In)、鉍(Bi)作為內標,補償基體效應,采用ICP-MS同時測定砷、鉛、汞、鎘、銅5種元素。(4)①采用UFLC-MS-MS法測定大鼠血漿與腦脊液中常春藤皂苷元的濃度。血漿樣品選用甲醇沉淀蛋白處理,而腦脊液用乙酸乙酯萃取,然后N2吹干濃縮,以異戊巴比妥為內標,選用XR-ODS II(75 mm×2.0 mm,i.d.,2.1μm)柱進行分離,流動相為5 mM醋酸銨和乙腈(v/v)梯度洗脫,流速0.35 mL/min。通過電噴霧離子

5、化,負離子檢測,優(yōu)化質譜條件,常春藤皂苷元的定量離子m/z471.5→393.4,內標異戊巴比妥定量離子m/z225→182。考察了樣品在各種儲藏條件下,如長期(-20℃,7d)、短期(25℃,4h)、凍融(n=3)以及樣品處理后的穩(wěn)定性,同時也考察了方法的回收率、基質效應、精密度、準確度。②常春藤皂苷元藥代動力學探索:SD大鼠,按100 mg/kg、400 mg/kg兩個劑量,單次給藥,分別在0,5,10,15,20,30,60,90

6、,120,150,180,210,240,300 min采集血樣備用。腦脊液樣品,分別在給藥前與給藥后20 min采集備用。運用DAS2.1.1軟件計算藥代動力學數據。(5)FAE抗抑郁的作用:①建立皮質酮(corticosterone,Cor)損傷的PC12細胞模型,觀察常春藤皂苷元對照品和預知子提取物(FAE)對細胞形態(tài)、細胞活力的影響。②建立抗抑郁活性的藥效學初篩模型,雄性昆明小鼠隨機分成5組,即溶劑對照[0.5％羧甲基纖維素鈉(

7、CMC-Na)溶液]組、hederagenin(10mg/kg、50mg/kg)組、FAE(100mg/kg)組、草酸-S-西酞普蘭(escitalopram,ESC)陽性對照(6.25 mg/kg)組,各組動物每日灌胃1次,每次0.2 mL/10g,連續(xù)給藥7天。建立小鼠的行為絕望模型,末次給藥24小時后分別進行強迫游泳實驗(the forced swimming test,FST)和懸尾實驗(the tail suspension

8、test,TST)不動時間記錄,以及自主活動計數。
　　 結果:(1)FAE中含約70％的常春藤皂苷元及少量的齊墩果酸和熊果酸,在相應的濃度范圍內三種化合物對照品的標準曲線線性良好,三批樣品中平均含量常春藤皂苷元為70.60％±2.29％；齊墩果酸為2.09％±0.12％,熊果酸為5.32％±0.10％。(2)自動頂空GC-MS法檢測FAE中有機溶劑的殘留量:結果三批預知子提取物中乙酸乙酯與正丁醇均未檢出,乙醇平均百分含量:從0

9、.14％(RSD,4.6％)-0.31％(RSD,3.9％)(n=3)。結果顯示預知子提取物中乙醇殘留均低于0.5％,符合《中國藥典》2010版的溶劑殘留標準。(3)ICP-MS法中5種重金屬元素的標準曲線線性良好(r>0.9993),平均回收率95.6％～108.0％,RSD<10.3％。預知子藥材與FAE中5種重金屬含量分別為:Pb(2.11±0.09)μg/g,(1.48±0.02)μg/g；As(0.26±0.03)μg/g,(

10、0.22±0.02)μg/g；Cd(0.038±0.001)μg/g,(0.017±0.002)μg/g；Hg(0.037±0.010)μg/g,(0.026±0.007)μg/g,Cu(14.46±0.50)μg/g,(14.45±0.29)μg/g。結果表明預知子藥材及FAE中5種有害重金屬元素的含量均低于《中國藥典》2010版的限量標準。(4)首次建立了檢測血漿和腦脊液的中常春藤皂苷元的UFLC-MS-MS法,常春藤皂苷元在0.4

11、06-200 ng/mL范圍內:血漿中:y=0.0245x+0.00671,r=0.9981,腦脊液中:y=0.0520x+0.0529,r=0.9960.日間差2.4％～8.9％,日內差1.1％～13.0％,準確度在-9.0％～11.1％之間。常春藤皂苷元在血漿及腦脊液中的回收率均大于85％,且血漿及腦脊液中內源性物質無干擾,基質無顯著影響。常春藤皂苷元在血漿及腦脊液中凍融(n=3)、長期(-20℃,7d)、短期和樣品處理后(25℃,

12、4h)穩(wěn)定性良好。表明方法的有效性符合美國食品藥品管理局對生物樣品的分析檢測要求。藥代動力學研究結果顯示,大鼠灌胃單次給藥100 mg/kg、400 mg/kg FAE:Cmax分別為11.21±0.50 ng/mL,47.73±1.39ng/mL；Tmax分別為20 min,18.33±2.58 min。血藥濃度消除半衰期t1/2為49.90±1.85 min,44.06±2.98 min。而AUC0-t分別為668.44±20.21

13、 ng/mL*min,3066.46±243.07 ng/mL*min,AUC0-∞為701.42±28.62 ng/mL*min,3131.47±236.83ng/mL*min。消除速率Ke為0.014±0.001和0.016±0.001。在單次給藥(400 mg/kgFAE)20 min時,腦脊液中常春藤皂苷元含量6.17±0.22 ng/mL(RSD,3.5％),表明常春藤皂苷元能穿透血腦屏障。(5)①細胞實驗中,常春藤皂苷元對照

14、品和FAE可顯著對抗Cor造成的PC12細胞損傷,模型組細胞A值為0.686±0.058,與溶劑對照組(0.983±0.054)相比較顯著降低,但經常春藤皂苷元(1,5,10μg/mL)和FAE(20μg/mL)(0.780±0.018、0.874±0.030、0.942±0.021；0.957±0.039)或5.0μg/ml ESC(0.956±0.036)預處理過的細胞,其A值較之于模型組細胞具有顯著升高(P=0.000)。常春藤皂

15、苷元和FAE可顯著對抗Cor所致的細胞氧化損傷。②常春藤皂苷元連續(xù)7天重復給藥后,在FST中與溶劑對照組(198.4±43.96s)比較,給予劑量為10 mg/kg、50 mg/kg常春藤皂苷元,100 mg/kg FAE或ESC陽性對照組的小鼠游泳不動時間分別為115.9±30.49、110.1±26.49、97.4±22.24、100.25±20.63s,不動時間顯著減少；TST中各實驗組組間差異顯著(P=0.000),不同給藥劑量

16、10mg/kg(197.89±30.65 s)、50 mg/kg(128.38±36.49 s)常春藤皂苷元,100 mg/kg(119.67±23.64 s)FAE以及ESC陽性對照組(109.89±22.75s)小鼠,與溶劑對照組(228.13±40.34 s)相比,均顯著縮短了空中不動時間;小鼠自主活動檢測實驗中,常春藤皂苷元和FAE給藥組及ESC組小鼠與溶劑對照組相比較,水平活動計數值均無顯著性差異(P=0.799)。
　

17、　 結論:FAE中常春藤皂苷元含量達68％,有機溶劑殘留量及重金屬檢測,符合《中國藥典》2010版的相關標準,能夠滿足二類中藥新藥的要求。檢測血漿及腦脊液中常春藤皂苷元的UFLC-MS/MS法,具有高靈敏度,高選擇性,可有效用于藥代動力學的研究,藥代動力學結果顯示,常春藤皂苷元可經腸胃快速吸收分布到血液及腦脊液中,表明常春藤皂苷元能穿透血腦屏障。常春藤皂苷元和FAE均對Cor誘導的PC12細胞損傷模型具有明顯的保護作用；并可顯著改善行