創(chuàng)傷性腦損傷后移植神經(jīng)干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：日常生活中由于交通事故、生產(chǎn)事故、自然災(zāi)害等常見原因，創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury,TBI）的發(fā)病率一直居高不下，部分患者殘留肢體殘疾、嚴(yán)重者甚至發(fā)生死亡，嚴(yán)重影響著人類的生命健康、生活質(zhì)量和財(cái)產(chǎn)安全。由于神經(jīng)細(xì)胞毀損后自身欠缺再生能力，創(chuàng)傷性腦損傷后的多數(shù)幸存者中會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)功能的不全或缺失，從而喪失部分或全部的勞動(dòng)生產(chǎn)能力和生活自理能力，給社會(huì)和家庭帶來了龐大的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)功能的保護(hù)和修復(fù)作為創(chuàng)傷性腦

2、損傷后臨床治療中的關(guān)鍵所在，一直以來面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，對(duì)于傷后出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙尚無特異性明確有效的治療方法。因此需要我們探索新的行之有效的治療方法來改善目前困窘的局面。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自身修復(fù)的局限性，人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）后所進(jìn)行的治療作用的研究，讓我們看到了勝利的曙光。目前神經(jīng)干細(xì)胞的體外研究已日趨成熟，嘗試神經(jīng)干細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性腦損傷也得到了越來越多的重視。本研究中從神經(jīng)干細(xì)胞

3、的分離培養(yǎng)入手，在體外對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記、鑒定，研究其增殖能力及誘導(dǎo)分化后的表型特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上將體外標(biāo)記好的神經(jīng)干細(xì)胞移植到模型鼠腦內(nèi)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞在宿主腦內(nèi)的分布、遷移和分化，從形態(tài)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能恢復(fù)等方面來評(píng)估細(xì)胞移植治療的修復(fù)作用，為腦外傷的治療探索新途徑并提供理論佐證。
　　方法：⑴取1-2d新生昆明小鼠，機(jī)械分離海馬、嗅球組織，并提取其中的細(xì)胞。體外篩選培養(yǎng)3周后，選取穩(wěn)定懸浮的細(xì)胞進(jìn)行 BrdU標(biāo)記，進(jìn)行抗Brd

4、U+Nestin+Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞的類型。體外誘導(dǎo)促使神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生貼壁、分化，對(duì)分化產(chǎn)生的子代細(xì)胞進(jìn)行抗BrdU、β-TubulinⅢ、GFAP、Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色確定分化表型。⑵采取改良的Feeney氏自由落體法撞擊構(gòu)建所需的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，建模后1d進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，分別在移植當(dāng)天（移植后0d）、移植后3d、移植后7d、移植后14d、移植后21d進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度（NS

5、S）評(píng)分及疲勞轉(zhuǎn)棒測(cè)試，移植后7d、21d進(jìn)行抗Brdu、Nestin、GFAP、β-TubulinⅢ免疫熒光染色。
　　結(jié)果：①?gòu)男律蠛ｑR及嗅球組織提取得到的細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后可形成穩(wěn)定懸浮的類球形桑葚狀細(xì)胞團(tuán)，且抗BrdU+Nestin+Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色均呈陽性。所提取的細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化后可產(chǎn)生（抗BrdU+β-TubulinⅢ+Hochest33258）陽性、（抗BrdU+GFAP）陽性的子代細(xì)胞

6、。②移植后7d、14d、21d神經(jīng)干細(xì)胞移植組的NSS評(píng)分分別為（10.22±1.42、7.44±1.17、6.22±1.06），對(duì)照組的NSS評(píng)分分別為（12.44±2.01、9.44±1.91、7.33±1.63），神經(jīng)干細(xì)胞移植組的NSS評(píng)分低于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；移植后14d、21d神經(jīng)干細(xì)胞移植組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間分別為（274.21±4.34s、292.88±4.53s），對(duì)照組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間分別為（244.3

7、2±9.55s、250.48±10.87s），神經(jīng)干細(xì)胞移植組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；移植后7d腦組織切片行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BrdU/Nestin雙陽性細(xì)胞局限于移植進(jìn)針的“隧道”，移植后21d腦組織切片行免疫熒光染色在腦損傷區(qū)域及周圍發(fā)現(xiàn)BrdU/GFAP雙陽性細(xì)胞及BrdU/β-TubulinⅢ雙陽性細(xì)胞。
　　結(jié)論：⑴新生鼠海馬、嗅球的組織中含有豐富的神經(jīng)干細(xì)胞來源，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞能夠進(jìn)