STGC3基因低表達對NP69細(xì)胞的影響及機制研究.pdf

1、目的：本研究運用 shRNA技術(shù)，敲低永生化人鼻咽黏膜上皮NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達，構(gòu)建STGC3穩(wěn)定低表達NP69細(xì)胞，分析STGC3基因表達降低對其生長、增殖、侵襲、遷移及裸鼠成瘤能力等生物學(xué)行為的影響；應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析STGC3基因低表達對NP69細(xì)胞蛋白質(zhì)表達譜的影響，篩選與鑒定差異表達蛋白質(zhì)分子，實驗驗證與分析差異表達蛋白質(zhì)分子的功能，明確STGC3基因在鼻咽黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程可能發(fā)揮的作用及其分子機制

2、，為全面揭示STGC3基因的功能提供實驗依據(jù)。
　　方法：根據(jù)堿基序列設(shè)計靶向干擾STGC3基因的shRNA，構(gòu)建真核表達干擾載體，應(yīng)用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞，經(jīng)不同濃度G418篩選，建立STGC3穩(wěn)定低表達的NP69細(xì)胞系，運用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實驗，分析觀察其生長、增殖及細(xì)胞周期的變化；同時分別采用Transwell小室及裸鼠成瘤實驗，分析探究其遷移、侵襲能力及裸鼠成瘤能力的變化

3、；再運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選、鑒定其差異表達蛋白質(zhì)分子，分析其生物學(xué)功能；并運用IPA（Ingenuity Pathways Analysis）分析差異蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。隨后運用RT-PCR、Western-Blotting驗證部分差異蛋白質(zhì)分子的表達，并檢測其在鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中的表達；在此基礎(chǔ)上進一步干預(yù)差異表達蛋白質(zhì)分子的功能，研究其對STGC3基因低表達NP69細(xì)胞系及鼻咽癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲與遷移能力的影響，同時

4、檢測其相關(guān)信號通路蛋白質(zhì)分子的表達。
　　結(jié)果：經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，確定成功構(gòu)建了STGC3真核表達干擾載體并命名為pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3。將其與對照質(zhì)粒pRNAi-U6.1/scramble分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞并經(jīng)400μg/ml G418篩選后，熒光顯微鏡下能見到轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3干擾載體轉(zhuǎn)染 NP69細(xì)胞后，STGC3

5、 mRNA水平顯著低于對照組，表明該干擾載體能成功敲低NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達，穩(wěn)定低表達STGC3的NP69細(xì)胞（pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞）建立成功。
　　細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果顯示，從第4天開始，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞生長增殖速度明顯快于對照組；其所形成的細(xì)胞集落數(shù)目明顯多于對照組，集落體積也大于對照組（p<0.05），表明STGC3基

6、因低表達后能促進NP69細(xì)胞生長增殖，增強其克隆形成能力。FCM分析結(jié)果表明，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞處于（G2+S）期比例明顯高于對照組(p<0.05)，表明STGC3基因低表達后能影響細(xì)胞周期進程，提高細(xì)胞增殖速度及克隆形成能力。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，未包被Matrigel時，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)（320.42±28.54）明顯多于pR

7、NAi-U6.1/scramble/NP69細(xì)胞（206.26±15.40）及未轉(zhuǎn)染的NP69細(xì)胞（180.72±16.03）；包被 Matrigel時，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)（116.33±3.55）也明顯多于對照組[分別為（43.00±2.00）、（40.67±2.52）]，差異均有顯著性意義(p<0.05)，表明STGC3基因低表達后能增強NP69細(xì)胞的遷移、侵襲能力；將pRNAi-

8、U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞及對照組細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，經(jīng)8周飼養(yǎng)并觀察，但均未見腫瘤的形成。
　　iTRAQ同位素標(biāo)記及質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果顯示，與對照組比較，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達譜發(fā)生改變，共鑒定出表達差異明顯的蛋白質(zhì)分子83種，其中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有45種，包括mTOR、TPM2、Cofilin-1、ANXA3、Musashi-2、Kindlin-2等；表達

9、下調(diào)的蛋白質(zhì)有38種，包括Beclin-1、TSC-22、AMOTL2等，這些差異蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞生長增殖、蛋白質(zhì)合成、物質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架、信號傳導(dǎo)及自噬等細(xì)胞生命活動過程。IPA蛋白質(zhì)相互作用分析軟件表明，這些差異表達蛋白之間形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，影響pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞的功能。
　　經(jīng)過RT-PCR、Western-Blotting及免疫組化等檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，pRNAi-U6

10、.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞中mTOR表達增強、Beclin-1表達降低，證實了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性；同時檢測發(fā)現(xiàn)在CNE1、CNE2鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中也存在mTOR表達增強、Beclin-1表達降低，且鼻咽癌組織中mTOR蛋白的表達與Beclin-1蛋白表達呈負(fù)相關(guān)；臨床Ⅲ、Ⅳ期患者及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中mTOR蛋白陽性表達率分別高于臨床Ⅱ期患者及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異具有顯著性意義(p<0.05

11、)。
　　應(yīng)用不同濃度(0、1、2、4、8μmol/L)的雷帕霉素處理pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE1、CNE2細(xì)胞后，雷帕霉素能顯著抑制pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞的生長增殖，且變化呈濃度依賴性，而不同濃度雷帕霉素作用不同時間后均對CNE1細(xì)胞無明顯抑制作用。同一濃度雷帕霉素處理24h后，對pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞

12、的抑制率低于處理48h和72h的抑制率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而處理48h和72h的抑制率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。8μmol/L雷帕霉素處理48h后，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞遷移、侵襲能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但雷帕霉素對CNE1細(xì)胞遷移、侵襲能力無明顯影響。Western blot檢測結(jié)果顯示，雷帕霉素處理48h后，pRNAi-U6.1/shRNA/STGC

13、3/NP69細(xì)胞、CNE2細(xì)胞中P-p70S6K和cyclinD1的表達降低，但mTOR、p70S6K蛋白的表達無明顯變化；而8μmol/L雷帕霉素處理48h后，CNE1細(xì)胞中mTOR、p70S6K、P-p70S6K和cyclinD1的表達較處理前均無明顯變化；這些結(jié)果表明雷帕霉素能抑制pRNAi-U6.1/shRNA/STGC3/NP69和CNE2細(xì)胞生長增殖及遷移、侵襲能力，可能與抑制其P-p70S6K和cyclinD1的表達有關(guān)。