發(fā)酵酒中啤酒的飲用后的鑒別技術(shù)研究.pdf

1、目的:
　　 1．尋找啤酒中具有鑒別意義的特征性物質(zhì)；
　　 2．建立啤酒特征性物質(zhì)的HPLC-MS/MS的檢測(cè)方法；
　　 3．建立啤酒特征性物質(zhì)的固相萃取方法,并比較不同固相萃取柱以及液液萃取方法的回收率區(qū)別，并選擇最優(yōu)的方法；
　　 4．分別對(duì)各類發(fā)酵酒（包括啤酒、紅酒和白酒）進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)所選特征性物質(zhì)能用來(lái)鑒別各種酒類，為飲酒后導(dǎo)致的各類案件的檢材采取、檢測(cè)、結(jié)果分析及法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)；<

2、br>　　 5．研究各種發(fā)酵酒飲用后，生物檢材(包括唾液、尿液和血液)中通過(guò)對(duì)特征性物質(zhì)的檢測(cè)，推斷是否飲用過(guò)啤酒。
　　 方法:
　　 1．通過(guò)文獻(xiàn)查新了解各種發(fā)酵酒中微量物質(zhì)的差異以及啤酒特征性物質(zhì)的初步確定；
　　 2．啤酒特征性物質(zhì)的LC-MS/MS 檢測(cè)條件的優(yōu)化：采用保留時(shí)間(Rt)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)對(duì)特征性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。選擇2-3對(duì)離子定性，以1對(duì)響應(yīng)值相對(duì)較高的特征離子的峰面積與其溶

3、液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法進(jìn)行定量。
　　 3．啤酒特征性物質(zhì)的提取方法的優(yōu)化：分別比較采取液液萃取和固相萃取方法方法的回收率，分析固相萃取柱包括Waters Sep-Pak C18和proElut C18 6cc (1000mg)。分別分析不同的PH 條件下回收率，對(duì)洗滌溶劑和洗脫液做最優(yōu)選擇，建立固相萃取方法。
　　 4．人體飲用各種發(fā)酵酒后，通過(guò)對(duì)人體生物樣本中啤酒的特征性物質(zhì)的研究,甄別是否飲用啤酒的研究：

4、>　　 5．人體試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，健康自愿者10人受試前三天禁酒，避免激烈的運(yùn)動(dòng)，保持良好的心態(tài)，將受試者隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)小組：讓自愿者飲酒前排尿作為空白對(duì)照，在1小時(shí)內(nèi)勻速飲酒達(dá)最大耐受量，邊飲酒邊進(jìn)食，食物葷素搭配適當(dāng)。自開(kāi)始飲酒后兩個(gè)小時(shí)自靜脈采血5～8mL，并收集唾液約3mL,在自愿者有尿意時(shí)收集中段尿，收集三次，并對(duì)收集時(shí)間做詳細(xì)的記錄，將采集的血液、尿液、唾液等人體生物樣本放置于-20冰箱中保存，待檢。第一組志愿者6人，飲用

5、啤酒；第二組志愿者2人，飲用紅酒；第三組志愿者2人，飲用白酒。6．生物樣本的前處理及固相萃取a. 檢材的前處理：取出檢材，解凍后高速離心，4000r/min的速度離心3分鐘，取離心后的上清液3mL，加入50mM(PH 約為3)甲酸銨緩沖液3mL，混勻備用；酒樣超聲除氣40min 加入甲酸調(diào)節(jié)PH，放置備用；b. 活化和平衡：取ProElut C18 6cc (1000mg)柱，5mL 甲醇活化，4mL水平衡，2mL 甲酸銨緩沖液再活化，

6、流速為3mL/min；c.上樣：處理好的檢材以1mL/min的流速過(guò)柱；d. 洗滌：6mL水洗后50mM(PH 約為3)3mL 甲酸銨緩沖液洗滌，流速為2mL/min;e. 吹干：用洗耳球吹干柱中殘余的水分；f. 洗脫：B 洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為1mL/min；g. 收集：40℃下氮?dú)獯?min，LC-MS/MS分析，采用保留時(shí)間很特征性離子對(duì)定性定量分析。
　　 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，用SP

7、SS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢材中的異α-酸含量進(jìn)行方差分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.黃腐酚經(jīng)HPLC/MS/MS分析，結(jié)果表明在0.5～40.0μg/mL 范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9929， 最低檢測(cè)限（LOD）為0.5μg/mL。
　　 2.異-α酸經(jīng)液相分離，質(zhì)譜分析，結(jié)果表明在0.1～31.163.0μg/mL 范圍內(nèi)血液呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9945。異α-酸

8、的標(biāo)準(zhǔn)溶液制成不同濃度，進(jìn)行HPLC/MS/MS分析，檢測(cè)結(jié)果顯示最低檢測(cè)限（LOD）為0.01μg/mL,信噪比（S/N）為4.5。
　　 結(jié)論:
　　 1．據(jù)課本及文獻(xiàn)報(bào)道：黃腐酚只存在于酒花中，所以啤酒黃腐酚的唯一來(lái)源，出于這個(gè)原因，考慮黃腐酚能用來(lái)區(qū)別啤酒和其它酒種。不同的啤酒中黃腐酚的含量不同，市售的大部分啤酒的黃腐酚含量小于0.1mg/L，國(guó)內(nèi)外有相關(guān)的報(bào)道，檢測(cè)到部分啤酒的黃腐酚的含量超過(guò)1mg/L，有的甚

9、至高達(dá)2mg/L。
　　 2．經(jīng)過(guò)固相萃取及高效液相色譜并聯(lián)質(zhì)譜對(duì)啤酒中黃腐酚的分析和檢測(cè)，結(jié)果可知，與報(bào)道相符，在大部分啤酒中的黃腐酚含量在0.04～0.2mg/l，對(duì)于經(jīng)過(guò)特殊加工了的啤酒會(huì)高一些。實(shí)驗(yàn)證明，啤酒中的這種物質(zhì)如此甚微，用現(xiàn)有的條件不足以鑒別是否喝過(guò)啤酒。
　　 3．本文建立了生物檢材中異α-酸的固相萃取方法和HPLC-MS/MS 檢測(cè)方法，靈敏度高，回收率高，重現(xiàn)性好，方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，樣品不需要衍

10、生化處理，方法建立后適用于生物檢材的快速檢測(cè)。
　　 4．在啤酒中檢測(cè)中異α-酸的含量，市售的啤酒中含量差別很大，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出：無(wú)醇啤酒中異α-酸的含量相對(duì)較低，而黑啤中的高了很多，這跟啤酒釀造過(guò)程中酒花添加量和工序有關(guān)。
　　 5．人體飲用啤酒后，異α-酸在人體內(nèi)的分布個(gè)體差異性很大，唾液在開(kāi)始喝酒的1.5小時(shí)后采集的第一次，濃度高于第二、三次。尿液是在喝酒后0.5小時(shí)后開(kāi)始采集，第一次尿含量幾乎沒(méi)有，異α-酸