維通注射劑對(duì)腹膜成纖維細(xì)胞的影響及組方研究.pdf

1、研究背景：
　　 術(shù)后組織粘連是結(jié)締組織纖維帶和相鄰組織或器官結(jié)合在一起而形成的異常結(jié)構(gòu)。從外科手術(shù)開展到現(xiàn)在,術(shù)后粘連的形成就成為一個(gè)棘手的問題。腹部粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥,可引起粘連性腸梗阻、女性不育和腹盆腔慢性疼痛等疾病,除了給病人帶來(lái)痛苦,其經(jīng)濟(jì)代價(jià)也是高昂的。但是臨床上至今尚無(wú)安全、有效、方便的防治腹部術(shù)后粘連的藥物和方法。近年來(lái),隨著中醫(yī)藥研究的快速發(fā)展,很多中藥被應(yīng)用到臨床防治術(shù)后粘連。中藥有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),如多

2、靶點(diǎn)發(fā)揮療效、毒副作用小、易被患者接受等,成為防治術(shù)后粘連的一個(gè)重要途徑,有較好的研究前景和開發(fā)價(jià)值。
　　 WTI是南方醫(yī)院藥學(xué)部在常通口服液研究的基礎(chǔ)上,研制出的中藥粉針劑型。其主要活性成分由中藥D和皂苷Q組成(D、Q質(zhì)量比為1:1),具有改善微循環(huán)、抑制炎癥反應(yīng)、抗?jié)B出的藥理功效,臨床上主要用于防治術(shù)后粘連。WTI具有起效迅速且不受術(shù)后禁食期限制等優(yōu)點(diǎn),可在腹部手術(shù)后早期使用,可能成為術(shù)后粘連防治體系中的又一個(gè)重要新藥。<

3、br>　　 目的：
　　 從細(xì)胞分子水平探討WTI主要成分防治術(shù)后粘連的作用機(jī)制,觀察D和Q對(duì)體外培養(yǎng)的正常腹膜和粘連腹膜FB的影響;在體外定量分析WTI中D和Q聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同、相加或拮抗作用；確定D和Q的最佳配比組方并研究其對(duì)FB的影響,證實(shí)最佳配比組方的合理性,為該藥的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。
　　 方法：
　　 1大鼠正常腹膜及粘連腹膜FB的體外培養(yǎng)與鑒定
　　 制備大鼠術(shù)后粘連模型,采用

4、組織塊貼壁法培養(yǎng)FB,待細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出并且融合成致密單層后,用胰蛋白酶消化,以1:3傳代。本實(shí)驗(yàn)選用的FB為第3～8代。倒置相差顯微鏡下觀察FB形態(tài),并對(duì)培養(yǎng)的FB進(jìn)行波形蛋白免疫組化鑒定。
　　 2 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的作用研究
　　 2.1 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NFB與AFB,分別接種至96孔板,每種細(xì)胞均設(shè)D、Q、D+Q3個(gè)

5、組,每組均設(shè)6個(gè)藥物處理濃度,分別為4、8、16、32、64、128μg/ml,D+Q組的藥液按照WTI中D與Q的質(zhì)量比配制(D:Q=1:1)。正常對(duì)照組加不含藥物的培養(yǎng)液200μl,以不含F(xiàn)B的培養(yǎng)液作空白對(duì)照,培養(yǎng)72h后,MTT法測(cè)定各孔吸光度,計(jì)算各個(gè)濃度下的生長(zhǎng)抑制率(IR),并求出各藥的半數(shù)抑制率(IC50),利用中效原理判斷聯(lián)合用藥對(duì)NFB和AFB的效應(yīng)。
　　 2.2 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB膠原合

6、成的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,24孔培養(yǎng)板每孔加入3×104個(gè)/ml的FB1 ml,每種細(xì)胞均設(shè)D、Q兩組,分別加入含終濃度為24、48、96μg/ml的D培養(yǎng)液和終濃度為16、32、64μg/ml的Q培養(yǎng)液。加藥后72 h測(cè)定培養(yǎng)液中Hyp的含量,測(cè)定膠原合成水平。
　　 2.3 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔加入

7、3×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)72h后棄上清,每種細(xì)胞均設(shè)D、Q兩組,D、Q組分別加入終濃度為24、48、96μg/ml的D、Q培養(yǎng)液。48 h后取上清,用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定LDH活性。
　　 2.4 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)胞遷移的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,以1×105/孔密度接種于已做好標(biāo)記的6孔板,于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),每種細(xì)胞均設(shè)D、Q兩組。72 h待細(xì)胞融合后,建立

8、體外細(xì)胞劃痕創(chuàng)傷模型,D、Q兩組分別加入48μg/ml的D和Q,培養(yǎng)24 h后,觀察藥物對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　 3 WTI主要成分的優(yōu)化配比研究
　　 采用與2.1相同的MTT方法檢測(cè)NFB和AFB細(xì)胞增殖活性,以細(xì)胞增殖抑制率作為考察指標(biāo)。根據(jù)權(quán)重配方法初步實(shí)驗(yàn)設(shè)不同配比組方6組,由結(jié)果分析得出最佳理論配比。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步做確證性實(shí)驗(yàn)考察兩組分的聯(lián)合作用。
　　 4 WTI的最佳組方對(duì)正常與粘連腹膜FB增殖

9、影響的研究
　　 4.1 D、Q最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,接種于96孔板,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,方法同2.1,培養(yǎng)24h后加入含有各濃度最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,再用MTT比色法測(cè)定吸光度值,計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
　　 4.2 D、Q最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,接種于24孔板,同時(shí)設(shè)陰性

10、對(duì)照組,方法同2.3,加入含有各濃度最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取上清,用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定LDH活性。
　　 4.3 D、Q最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)胞遷移的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,接種于6孔板,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,方法同2.4,加入含有48μg/ml最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,劃痕實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　 4.4 D、Q最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)

11、胞周期的影響
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB接種至培養(yǎng)皿中,設(shè)空白和最佳組方藥物組,其中藥物組的濃度為48μg/ml,在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72h,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組FB的細(xì)胞周期。
　　 4.5 D、Q最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB分泌細(xì)胞因子的影響
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFB與AFB,用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔加入3×104個(gè)細(xì)胞,24 h后吸棄培養(yǎng)液,加入終濃度為24、48、96μg/ml的

12、D、Q最佳組方培養(yǎng)液。正常對(duì)照組加不含藥物的培養(yǎng)液500μL。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,收集培養(yǎng)上清液,用ELISA方法檢測(cè)FB細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN—γ、IL-2的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1 NFB和AFB在體外培養(yǎng)條件下均較易貼壁生長(zhǎng),AFB比NFB生長(zhǎng)速度快。兩種細(xì)胞的波形蛋白免疫組化染色結(jié)果均為陽(yáng)性。
　　 2 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的作用研究
　　 2.1 WTI主要成

13、分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 D和Q單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)FB的生長(zhǎng)均有顯著的增殖抑制作用,且呈劑量依賴性。當(dāng)NFB組藥物效應(yīng)大于0.6或AFB組藥物效應(yīng)大于0.65時(shí),兩藥聯(lián)用后具有協(xié)同作同(CI<1)。
　　 2.2 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB膠原合成的影響
　　 AFB空白組培養(yǎng)液的Hyp含量明顯高于NFB空白組(P<0.05)。但是2種FB的D、Q藥物組與空白對(duì)照組相比,其Hyp含

14、量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.3 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 隨著Q濃度的增加,NFB和AFB細(xì)胞LDH漏出率逐漸增大,且48μg/ml和96μg/ml濃度的Q組與空白對(duì)照組相比存在顯著性差異。而D只在96μg/ml時(shí)LDH漏出率與AFB空白對(duì)照組相比有顯著性差異。
　　 2.4 WTI主要成分對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)胞遷移的影響
　　 NFB的對(duì)照組、D組和

15、Q組的細(xì)胞遷移率分別為8.7％±2.2％、2.2％±1.4％、2.7％±0.3％,AFB的對(duì)照組、D組和Q組的細(xì)胞遷移率分別為19.7％±1.6％、7.6％±1.6％和6.0％±1.4％,D、Q均可顯著抑制NFB和AFB的細(xì)胞遷移。
　　 3 WTI主要成分的優(yōu)化配比研究
　　 D在組方中量效關(guān)系相對(duì)明顯,為主藥,Q可能起到對(duì)主藥的協(xié)同或相加作用,二者最佳配比為9:2時(shí),可非常顯著抑制FB的增殖。
　　 4 WT

16、I的最佳組方對(duì)正常與粘連腹膜FB增殖影響的研究
　　 4.1最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 不同濃度的最佳組方作用于NFB和AFB72 h后,FB的增殖均有不同程度的抑制,濃度越大,其抑制效果越明顯。最佳組方以劑量依賴方式抑制FB的增殖。
　　 4.2最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的作用
　　 最佳組方作用于NFB和AFB72h后,各藥物劑量組的培養(yǎng)上清中LDH活性與對(duì)照組之間

17、比較,結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 4.3最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)胞遷移的作用
　　 NFB對(duì)照組與藥物組的細(xì)胞遷移率分別為7.7％±1.5％和2.6％±1.7％。AFB對(duì)照組與藥物組的細(xì)胞遷移率分別為30.0％±7.1％和2.4％±1.1％,NFB和AFB的藥物組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.001)。
　　 4.4最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB細(xì)胞周期的影響
　　 NFB

18、和AFB藥物組的G0/G1期百分?jǐn)?shù)顯著高于相應(yīng)的空白組,S期的百分?jǐn)?shù)則顯著低于相應(yīng)的空白組,而G2/M期的百分?jǐn)?shù)與相應(yīng)的空白組相比無(wú)顯著性差異。
　　 4.5最佳組方對(duì)正常腹膜與粘連腹膜FB分泌細(xì)胞因子的影響
　　 不同濃度的藥物作用于NFB和AFB后,隨著藥物濃度增大,TNF-α和IFN-γ分泌量逐漸減少。而NFB和AFB分泌的IL-1,藥物組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

19、 1、組織塊培養(yǎng)法所獲得的FB可在體外穩(wěn)定培養(yǎng),這為在細(xì)胞水平上研究術(shù)后粘連預(yù)防的作用機(jī)制提供了充足、可靠的靶細(xì)胞。
　　 2、WTI主要成分D、Q對(duì)FB增殖和遷移有抑制作用,能降低FB活性,但是對(duì)膠原合成沒有影響,WTI中D和Q聯(lián)合應(yīng)用對(duì)FB的增殖抑制具有協(xié)同作用。
　　 3、WTI主要成分D、Q的最佳組方配比為9:2。
　　 4、D、Q最佳組方在一定的劑量范圍內(nèi)對(duì)FB增殖和遷移有抑制作用,不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性；