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文檔簡(jiǎn)介
1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是許多心腦血管疾病的發(fā)病病理學(xué)基礎(chǔ),其機(jī)制復(fù)雜,是冠心病、心肌梗死、心絞痛等疾病死亡的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與炎癥、氧化應(yīng)激、脂蛋白聚集等密切相關(guān),病理學(xué)特征性改變主要是內(nèi)皮損傷、單核細(xì)胞黏附、脂質(zhì)顆粒聚集、泡沫細(xì)胞形成以及血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移,最終導(dǎo)致內(nèi)膜增生和粥樣斑塊的形成。通心絡(luò)(TXL)作為一種中藥復(fù)合制劑,由十二種動(dòng)植物草藥成分組成,已經(jīng)應(yīng)用于臨床二十多年,是由人參、酸棗仁、赤芍、檀香、降香、水蛭、
2、蟬蛻、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲(chóng)、乳香及冰片等十二味中藥的復(fù)方提取物。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明該藥可以明顯改善內(nèi)皮功能,降低血脂水平,減少動(dòng)脈粥樣硬化的形成并穩(wěn)定易損斑塊,因此,具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。外泌體是一類(lèi)細(xì)胞在特定條件下外分泌的小囊泡,包含有許多遺傳物質(zhì),發(fā)揮細(xì)胞間信息傳遞的作用。外泌體包含的微小RNA是以RISC蛋白復(fù)合物結(jié)合的形式存在,處于可直接與信使RNA相互作用的功能性狀態(tài),發(fā)揮特定生物學(xué)功能。近些年來(lái),外泌體作為心血管疾病的治療靶點(diǎn)
3、被越來(lái)越多地研究人員所重視,并且有很多研究已經(jīng)證實(shí)外泌體對(duì)心臟的保護(hù)起著重要的作用。本研究分為兩個(gè)部分:
第一部分:KLF5調(diào)控miR-155的分泌及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。
目的:探討平滑肌源性KLF5對(duì)miR-155的調(diào)控作用及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。
方法:表達(dá)譜芯片和 Real-time PCR檢測(cè)平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pAd-KLF5或pAd后miRNA的表達(dá)。Real-time PCR和Weste
4、rn blot檢測(cè)oxLDL誘導(dǎo)KLF5在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。提取外分泌體,表達(dá)譜芯片和Real-time PCR檢測(cè)KLF5誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞源性miRNA外分泌情況。雙熒光報(bào)告基因分析檢測(cè)KLF5對(duì)miR-155啟動(dòng)子的激活作用。將標(biāo)記PKH的外分泌體加入內(nèi)皮細(xì)胞后固定,檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中外分泌體的熒光攝取情況。apoE-/-雄性小鼠尾靜脈注射HASMC源性pAd或pAd-KLF5 exosome,飼喂高脂飼料,8周后取小鼠血管,免疫熒光
5、觀察CD31表達(dá)、油紅O染色觀察斑塊形成以及原位雜交檢測(cè)miR-155的表達(dá)情況。伊文氏蘭染色檢測(cè)apoE-/-小鼠與apoE-/-miR-155-/-小鼠的內(nèi)皮滲透性。血管生成實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮細(xì)胞成血管和細(xì)胞間連接情況,Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的指標(biāo),MTS實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力。
結(jié)果:⑴表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá) pAd-KLF5與轉(zhuǎn)染 pAd相比能顯著誘導(dǎo)43種mi
6、RNA的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果驗(yàn)證,過(guò)表達(dá)KLF5組中miR-155和miR-146a的表達(dá)量均高于pAd-GFP組,而miR-143, miR-145,miR-221,和miR-222表達(dá)量低于pAd-GFP轉(zhuǎn)染組,與芯片結(jié)果一致。⑵Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示oxLDL可以顯著誘導(dǎo)KLF5在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。與過(guò)表達(dá)KLF5的結(jié)果相似,oxLDL可以顯著誘導(dǎo)miR-155和miR-14
7、6a的表達(dá),下調(diào)miR-143,miR-145,miR-221,和miR-222的表達(dá)。⑶電鏡圖片結(jié)果顯示平滑肌細(xì)胞可以通過(guò)外泌體的形式來(lái)分泌miRNA。收集轉(zhuǎn)染pAd或pAd-KLF5的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基,超速離心,收集外分泌體,芯片篩查結(jié)果顯示,miR-155在KLF5誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞源性的外分泌體中含量顯著增加。Real-time PCR結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)KLF5或加入oxLDL刺激后外泌體中miR-155的表達(dá)比對(duì)照組增加,與基因芯
8、片結(jié)果一致。當(dāng)平滑肌細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)KLF5和加入oxLDL刺激時(shí), Real-time結(jié)果顯示miR-155的表達(dá)上升,當(dāng)敲除KLF5后miR-155的表達(dá)下降。報(bào)告基因分析結(jié)果證明KLF5可以直接激活miR-155的啟動(dòng)子。⑷平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)結(jié)果顯示,上層平滑肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)pAd-KLF5或加入oxLDL后,內(nèi)皮細(xì)胞攝入熒光標(biāo)記的miR-155的數(shù)量較對(duì)照組明顯增加;而平滑肌細(xì)胞敲除 KLF5后,內(nèi)皮細(xì)胞攝
9、入miR-155的數(shù)量顯著減少。TritonX-100破壞外分泌體膜后,Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-155在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降。將標(biāo)記PKH的外分泌體加入內(nèi)皮細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF5過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)外分泌體的攝取。⑸apoE-/-雄性小鼠尾靜脈注射HASMC源性pAd或pAd-KLF5 exosome,飼喂高脂飼料,8周后取小鼠血管,油紅O染色結(jié)果顯示,注射平滑肌源性pAd-KLF5 ex
10、osome組斑塊明顯多于pAd exosome組,提示KLF5過(guò)表達(dá)的平滑肌源性外分泌體促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。⑹伊文氏蘭染色結(jié)果顯示 apoE-/-小鼠內(nèi)皮滲透性比 apoE-/- miR-155-/-小鼠增強(qiáng),提示miR-155的缺失有保護(hù)內(nèi)皮作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),KLF5過(guò)表達(dá)的平滑肌源性外分泌體后內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成血管能力下降。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明, KLF5過(guò)表達(dá)的平滑肌源性外分泌體后內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白指
11、標(biāo)beta-catenin,ve-cadherin,claudin1,ZO-1表達(dá)均顯著下降。內(nèi)皮細(xì)胞的滲漏性結(jié)果顯示,KLF5過(guò)表達(dá)的平滑肌源性外分泌體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞滲漏,給予anti-miR-155后,滲漏緩解。
第二部分:通心絡(luò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞中miR-155的表達(dá)及分泌。
目的:觀察通心絡(luò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的抑制作用及其機(jī)制。
方法:熒光原位雜交檢測(cè)miR-155的分布。細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低
12、miR-155對(duì)巨噬增殖和遷移影響。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)TXL對(duì)miR-155的表達(dá)的影響。Western blot檢測(cè)TXL對(duì)外分泌體包裝蛋白LRP1,RAB27a和RAB22a表達(dá)的影響。
結(jié)果:⑴原位雜交顯示人動(dòng)脈粥樣硬化血管組織中 miR-155的表達(dá)明顯高于正常血管組織。小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中miR-155的表達(dá)也明顯高于正常血管組織。⑵Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,KLF5或oxLDL促進(jìn)mi
13、R-155由內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入巨噬細(xì)胞。敲除KLF5后,巨噬細(xì)胞對(duì)miR-155的攝入明顯減少。細(xì)胞增殖遷移實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-155可以顯著增加巨噬細(xì)胞的增殖和遷移活性,當(dāng)敲低miR-155時(shí),細(xì)胞增殖和遷移能力顯著下降。⑶apoE-/-小鼠分別給予高脂飲食或高脂飲食灌胃TXL12周后,油紅染色結(jié)果顯示,通心絡(luò)顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),預(yù)孵育TXL可以顯著抑制過(guò)表達(dá)KLF5和oxLDL誘導(dǎo)的 miR-155表
14、達(dá)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),預(yù)孵育TXL后,外分泌體包裝蛋白LRP1,RAB27a和RAB22a的表達(dá)下降。
結(jié)論:①過(guò)表達(dá)KLF5或加入oxLDL可調(diào)控多種miRNA在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。②過(guò)表達(dá)KLF5可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)和分泌。③miR-155在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中高表達(dá)。④平滑肌源性miR-155通過(guò)外泌體進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞,抑制內(nèi)皮緊密連接蛋白的表達(dá),損傷內(nèi)皮,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。
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