脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片生物學(xué)特性研究.pdf

1、小腸粘膜下層（Small intestinal submucosa，SIS）是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，主要成分是膠原蛋白。SIS經(jīng)加工后制成的修復(fù)材料具有良好的生物相容性、適當(dāng)?shù)慕到庑?、低或無免疫原性、一定的機(jī)械強(qiáng)度等特性。目前， SIS修復(fù)材料廣泛用于血管、膀胱、腸道、肌腱以及泌尿系統(tǒng)等組織修復(fù)中。
　　本研究所采用的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片是由豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細(xì)胞、凍干、滅菌等工藝制成，臨床上擬通過長(zhǎng)期植入體內(nèi)修復(fù)疝氣、肛

2、瘺等部位軟組織的損傷。本研究針對(duì)脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片生物學(xué)特性中的降解規(guī)律和免疫毒性兩方面進(jìn)行臨床前研究，為其更安全、有效的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　?。?）為了更加可靠地研究脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片的免疫毒性，本研究利用細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）優(yōu)化大鼠免疫刺激模型，為其免疫毒性研究設(shè)立免疫刺激組。選取Wistar大鼠42只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、免疫抑制組、LPS給藥后6h組、L

3、PS給藥后12h組、LPS給藥后24h組和LPS給藥后48h組。對(duì)大鼠進(jìn)行給藥處理后取材并檢測(cè)以下指標(biāo)：大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）含量。結(jié)果顯示， LPS給藥后6h、12h組在免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子含量方面均出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較存在顯著性差異（p<0.05），而12h組的免疫刺激現(xiàn)

4、象更加明顯。LPS給藥后24h、48h組的免疫刺激現(xiàn)象不明顯；免疫抑制組在免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子含量等方面均出現(xiàn)一定的免疫抑制現(xiàn)象，與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較存在顯著性差異（p<0.05）。上述結(jié)果說明，大鼠腹腔注射LPS后12h的免疫刺激現(xiàn)象最明顯，可作為大鼠免疫刺激模型用于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片的免疫毒性研究中。
　?。?）本研究對(duì)脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片的免疫毒性進(jìn)行了

5、探討。選取Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對(duì)照組、免疫抑制組和免疫刺激組，依據(jù)考察周期將每組16只大鼠再隨機(jī)分為1、4、8和12周4個(gè)實(shí)驗(yàn)操作小組（n=4）。對(duì)大鼠進(jìn)行埋植/給藥處理后取材并檢測(cè)以下指標(biāo)：大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、免疫器官病理學(xué)、NK細(xì)胞殺傷活性、T淋巴細(xì)胞亞群、淋巴細(xì)胞增殖、補(bǔ)體C3蛋白含量、免疫球蛋白（IgG、IgM）含量、細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）含量。結(jié)果

6、顯示，第1、4、8和12周的各時(shí)間點(diǎn)，高劑量組、低劑量組與假手術(shù)對(duì)照組在大鼠體重變化、血液學(xué)參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學(xué)分析、T淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、免疫球蛋白含量、細(xì)胞因子含量的測(cè)定方面變化趨勢(shì)基本一致，各組數(shù)據(jù)間相比不存在顯著性差異（p>0.05）；高劑量組和低劑量組在NK細(xì)胞殺傷活性和補(bǔ)體C3含量測(cè)定方面與假手術(shù)對(duì)照組有一定差異。免疫刺激組大鼠在血液學(xué)參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學(xué)檢查、T淋巴細(xì)胞亞

7、群分析、淋巴細(xì)胞增殖方面出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.05）；免疫抑制組大鼠在血液學(xué)參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學(xué)檢查、T淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴細(xì)胞增殖方面出現(xiàn)不同程度的免疫抑制現(xiàn)象，與高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果說明，大鼠腹部皮下埋植脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片后未見明顯的免疫毒性反應(yīng)。
　　（3）本研究從體外降解和體內(nèi)降

8、解兩方面對(duì)脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片的降解規(guī)律進(jìn)行研究。體外降解包括加速降解和常規(guī)降解兩方面。其中加速降解是在0.5mg/mL的Ⅰ型膠原酶中震蕩進(jìn)行，于不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品碎片，計(jì)算其降解率。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脫細(xì)胞豬小腸粘膜疝修補(bǔ)片在0.5mg/mL的Ⅰ型膠原酶中逐漸降解，酶解20h降解率達(dá)到68％左右，此前的降解率均低于相同時(shí)間點(diǎn)下COOK疝修補(bǔ)片的降解率，此后二者降解率接近，至96h降解率均90%以上。常規(guī)降解是在0.01

9、M PBS中靜置進(jìn)行，于不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品碎片，計(jì)算其降解率。結(jié)果顯示，脫細(xì)胞豬小腸粘膜疝修補(bǔ)片靜置30d時(shí)幾乎未發(fā)生降解，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降解，至靜置180d時(shí)，降解率達(dá)到90%以上。體內(nèi)降解的體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)跟免疫毒性研究的埋植實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行，分別于大鼠腹部皮下植入脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片后1周、4周、8周和12周對(duì)其進(jìn)行埋植部位大體觀察和組織學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埋植部位大體觀察，隨著植入周期的延長(zhǎng)，第1、4、8周的脫細(xì)胞豬小腸

10、粘膜下層疝修補(bǔ)片不斷被結(jié)締組織包裹，并逐漸降解吸收，至植入12周脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片與周圍結(jié)締組織完全融合。組織學(xué)觀察，隨著植入周期的延長(zhǎng)，第1、4、8周的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片逐漸與周圍結(jié)締組織融合，炎癥細(xì)胞逐漸減少，至植入12周該材料與周圍結(jié)締組織基本融合，局部?jī)H見少量散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯炎癥病變。大鼠皮下植入脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片12周時(shí)，皮下脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層疝修補(bǔ)片基本完全降解。降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，脫