番木瓜環(huán)斑病毒CP基因IR表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及抗病性研究.pdf

1、生產(chǎn)上番木瓜普遍受到病毒侵害的困擾，其中番木瓜環(huán)斑病毒造成的危害由來已久。而抗番木瓜環(huán)斑病毒的番木瓜育種工作又遇到重重障礙，這些障礙包括缺乏對PRSV具有抗性的栽培品種，PRSV株系在不同地區(qū)有差別以及存在遠(yuǎn)緣雜交不親和現(xiàn)象。
　　 植物基因工程的發(fā)展為番木瓜抗PRSV提供了一條新的途徑。近幾年關(guān)于RNAi的研究眾多，其中的一大熱點(diǎn)就是用植物病毒本身的一段基因合成反向重復(fù)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以使其獲得遺傳穩(wěn)定的抗病性，這在很大程度上

2、解決了運(yùn)用傳統(tǒng)方法選育抗病株系的困難。
　　 本研究以番木瓜環(huán)斑病毒的寄主植物番木瓜和黃瓜為實(shí)驗(yàn)材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和PEG介導(dǎo)法將外殼蛋白CP基因反向重復(fù)表達(dá)載體導(dǎo)入受體材料中，并分析轉(zhuǎn)入基因?qū)χ参锏目共⌒缘挠绊懀饕芯拷Y(jié)果如下：
　　 (1)利用番木瓜的不同部位用不同的培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)番木瓜的莖段和幼胚能在C3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并誘導(dǎo)長出胚狀體。后者比前者所需時(shí)間更短。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)胚狀體還

3、能作為二次誘導(dǎo)胚狀體的材料，且需時(shí)更少。
　　 在用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對誘導(dǎo)得到的胚狀體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的過程中，由于農(nóng)桿菌的污染問題未能有效解決，而少數(shù)未污染的胚狀體在篩選培養(yǎng)基上逐漸褐化，未能得到轉(zhuǎn)化苗。
　　 (2)先利用黃瓜“津研4號”的不同部位作為外植體，用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)用黃瓜的子葉節(jié)作為外植體在培養(yǎng)基MS+1.5mg/L6-BA+2.0mg/LAgNO3上能誘導(dǎo)出狀態(tài)良好的不定芽，不定芽在1/2M

4、S培養(yǎng)基中能伸長生根。
　　 利用該黃瓜再生體系，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用不同的方法將含外殼蛋白CP基因反向重復(fù)表達(dá)載體pWatergate-CP861IR，pHellsgate12-CP2i5IR轉(zhuǎn)化受體材料，得到11株Kan抗性苗。經(jīng)PCR檢測，其中1株確認(rèn)為pWatergate-CP861IR轉(zhuǎn)化苗，3株為pHellsgate12-CP215IR轉(zhuǎn)化苗，陽性率為36.4％。而且發(fā)現(xiàn)這4株轉(zhuǎn)化苗都是在農(nóng)桿菌侵染時(shí)用超聲波處理了2～3

5、s的子葉節(jié)誘導(dǎo)得到的，其他方法都未能得到轉(zhuǎn)化苗，說明在農(nóng)桿菌侵染時(shí)用超聲波處理能夠提高轉(zhuǎn)化率。對得到的黃瓜轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行煉苗處理，并移栽到蛭石中，黃瓜轉(zhuǎn)化苗未能成活。
　　 (3)利用PRSV病葉提取PRSV粒子，提取得到的病毒濃度為1.0875mg/L。用番木瓜實(shí)生苗的葉片制備原生質(zhì)體，并用PEG介導(dǎo)法將pHellsgate12-CP861IR基因和PRSV粒子共轉(zhuǎn)化番木瓜原生質(zhì)體。提取原生質(zhì)體RNA，通過RT-PCR檢測pHel

6、lsgate12-CP861IR基因?qū)RSV的沉默抑制效果。
　　 結(jié)果顯示，該番木瓜品種為CP基因轉(zhuǎn)化品種，當(dāng)加入的PRSV量為0.2μg，2μg時(shí)，未能檢測到PRSV的CP基因，當(dāng)PRSV的量為20μg時(shí)，能檢測到PRSV的CP基因。當(dāng)10μg pHellsgate12-CP861IR基因和0.2μg，2ug或20μg PRSV粒子共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時(shí)，檢測不到CP基因，說明pHellsgate12-CP861IR基因的加入啟