柑橘花藥和小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制雙單倍體及其分子鑒定.pdf

1、隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，純系以其基因組簡單便于分析而備受關(guān)注。柑橘作為世界上最重要的水果之一，雖然已獲得部分純系材料，但群體較小且涉及的遺傳背景較為相似，因此，擴(kuò)大柑橘純系群體的工作任重道遠(yuǎn)。柑橘廣泛存在的珠心胚現(xiàn)象，以及童期長、基因組高度雜合等特點，使其無法通過傳統(tǒng)的自交獲得純系?；ㄋ幣囵B(yǎng)是創(chuàng)制柑橘純系群體的首選技術(shù)。游離小孢子培養(yǎng)為直觀地呈現(xiàn)胚離體再生過程提供可能，同時有效減輕后續(xù)篩選鑒定的工作量，該項技術(shù)已被應(yīng)用于多個物種。

2、本實驗通過花藥培養(yǎng)擴(kuò)大柑橘純系群體，并嘗試柑橘游離小孢子培養(yǎng);同時，對前人創(chuàng)制的純系材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。主要結(jié)果如下:
　　1.對柑橘9個品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，共再生85個胚狀體，其中枳32個，墨西哥萊檬24個，早花檸檬23個，早金甜橙3個，暗柳橙、露德紅夏橙、紅暗柳橙各1個。其中46個胚狀體生芽，部分離體嫁接于枳砧，隨后移栽至溫室，其它仍處于繼代過程中。選取部分胚狀體提取DNA，通過SSR分子標(biāo)記鑒定再生胚狀體的基因型，表明枳、紅暗

3、柳橙、早金甜橙均為雜合體;萊檬及墨西哥萊檬均為純合體，所有再生植株倍性均為二倍體?；ㄋ幣囵B(yǎng)過程中，比較花蕾大小、花期、低溫預(yù)處理時間對花藥培養(yǎng)再生率的影響，發(fā)現(xiàn)開花在12月的早花檸檬及1月的萊檬再生率明顯高于3月開花的枳，而4月開花的其它6個品種的再生率更低;低溫預(yù)處理7-8d，其再生率高于其它預(yù)處理。
　　2.對10個柑橘品種進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，參考前人的培養(yǎng)過程稍加改良，預(yù)處理液以0.4mol/L甘露醇為基礎(chǔ)設(shè)置3種處理，培養(yǎng)

4、基以MCM及BH3為基礎(chǔ)進(jìn)行多種改良，培養(yǎng)密度設(shè)置4個梯度。對比多種處理發(fā)現(xiàn)，以含1％DMSO的0.4mol/L甘露醇作為預(yù)處理液，小孢子細(xì)胞更傾向于形成類似胚狀體的致密細(xì)胞團(tuán)，但其它處理對小孢子細(xì)胞的再生幾乎沒有影響。該實驗中獲得的致密細(xì)胞團(tuán)沒有繼續(xù)發(fā)育。
　　3.對早金甜橙7個純系愈傷組織進(jìn)行染色體制片，獲得部分較清晰的染色體圖像，發(fā)現(xiàn)雙單倍體愈傷較單倍體愈傷更易發(fā)生染色體加倍，這些不同純系的染色體圖像可以用于后續(xù)的純系細(xì)胞學(xué)