紅背葉根總生物堿的提取分離及抗急性肝損傷小鼠的作用研究.pdf

1、背景:化學(xué)性肝損傷已成為繼病毒性肝損傷之后的第二大肝病誘因,目前臨床應(yīng)用的500至1000余種中西藥物以及多種化學(xué)藥品,均可引起不同程度的肝病。據(jù)國(guó)內(nèi)外資料報(bào)道,有20％的暴發(fā)性肝衰竭由化學(xué)藥物引起。近年來(lái),化學(xué)性肝損傷呈增加趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人們的生命健康。研究肝炎的發(fā)生機(jī)理及尋找有效的治療措施是國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同研究的熱門課題,大量研究表明,國(guó)內(nèi)很多專家學(xué)者把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向我們傳統(tǒng)的中藥,研究治療肝炎的中藥是目前我國(guó)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。但目

2、前臨床上仍缺乏有效的防治藥物,因而加強(qiáng)肝臟損傷保護(hù)研究、開(kāi)展對(duì)化學(xué)性肝病的防護(hù)工作,對(duì)于提高人類健康水平具有重要意義。
　　 西醫(yī)用于肝炎的治療多見(jiàn)于抗病毒藥、護(hù)肝降酶藥及免疫調(diào)節(jié)類藥物,目前臨床上常用的品種有干擾素、阿糖胞苷、干擾素誘導(dǎo)劑聚肌胞、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、左旋咪唑、轉(zhuǎn)移因子、輔酶Q、胸腺素、右旋兒茶素、甘草甜素、齊墩果酸、葫蘆素B、葫蘆素E、聯(lián)苯雙酯、維生素類等。臨床治療結(jié)果表明,這些藥物多具有良好的抑制病毒復(fù)制,恢復(fù)正常肝功

3、能,保護(hù)肝細(xì)胞等作用,并且療效迅速,不足之處為遠(yuǎn)期療效不穩(wěn)定,易反復(fù),HBsAg轉(zhuǎn)陰率低,有些藥品價(jià)格昂貴和表現(xiàn)一定的副作用。
　　 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝損傷的病因多與外感時(shí)邪、飲食失常、情志失調(diào)或正氣虛弱等有關(guān)。金實(shí)等認(rèn)為本病的病因主要是外感濕熱邪毒和飲食不當(dāng),并且與體虛勞倦有關(guān),病機(jī)變化主要為濕熱邪毒蘊(yùn)結(jié)肝脾,肝膽失疏,脾胃不健,氣滯血瘀,脈絡(luò)失和所致。連粵湘等認(rèn)為本病的病因病機(jī)為濕熱外侵或疫毒感染,郁于脾胃,以致濕熱熏蒸,脾失健運(yùn)

4、,肝失疏泄,肝脾不和,膽液外溢而為之。孫江橋等認(rèn)為本病的病因病機(jī)多為濕熱毒淤,肝郁氣滯,瘀血阻絡(luò),脾失健運(yùn),肝腎陰虛所致。中醫(yī)中藥具有不良反應(yīng)較少,可長(zhǎng)期服藥的特點(diǎn)。近年來(lái),中藥治療肝炎取得了良好的療效。
　　 生物堿(alkaloid)是存在于生物體(主要為植物)中的一類含氮的有機(jī)化合物,大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),氮原子多包含在環(huán)內(nèi),多呈堿性,可與酸成鹽,有顯著的生物活性,是中草藥中重要的有效成分之一。
　　 生物堿是研

5、究得最早的一類有生物活性的天然有機(jī)化合物。目前已分離到10000余種,其中80余種已用于臨床,如黃連中的小檗堿用于抗菌消炎,麻黃中的麻黃堿用于平喘,蘿芙木中的利血平用于降壓,喜樹(shù)中的喜樹(shù)堿與長(zhǎng)春花中的長(zhǎng)春新堿用于抗腫瘤等。
　　 目前已對(duì)數(shù)十種生物堿進(jìn)行了研究,麻黃堿、苦參堿、氧化苦參堿、秋水仙堿、煙堿、毒藜?jí)A、罌粟堿、吐根酚堿、半邊蓮堿、奎寧、辛可寧、紫堇堿、小檗堿、嗎啡、可待因、漢防己堿、延胡索乙素、吳茱萸堿、烏頭堿、馬錢子

6、堿、士的寧、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、厚樸堿、檳榔堿、檳榔次堿、東莨菪堿、山莨菪堿、木蘭堿、蝙蝠葛堿、青藤堿、青風(fēng)藤堿、蓮花氏堿、麥角新堿、利血平、紅豆杉醇、貝母堿等。其中許多以應(yīng)用于臨床并取得較好的療效,如麻黃堿、秋水仙堿、苦參堿、嗎啡、麥角新堿、延胡索乙素山莨菪堿等。文獻(xiàn)已有報(bào)道不少生物堿對(duì)肝臟具有保護(hù)作用,例如:粗葉懸鉤子總生物堿對(duì)急性肝損傷大鼠肝組織CYP2E1與CYP3A1酶mRNA表達(dá)的影響,巖黃連總堿提取物對(duì)小鼠免疫性肝損傷的改善

7、作用,鬼針草提取物對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的預(yù)防作用,氧化苦參素堿的抗乙型和丙型肝炎病毒效應(yīng),延胡索乙素對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。
　　 紅背葉根為雙子葉植物藥大戟科植物紅背山麻桿Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根,別名為名紅靈丹、紅羅裙、紅帽頂、紅背娘、紅骨白顴樹(shù)根。主要分布于我國(guó)中部和東南、華南。其味甘,性涼,根四季可采,載于《廣西中草藥》。灌木或小喬本,嫩枝有毛,生山坡、荒

8、地的灌叢中。具有清熱解毒,祛風(fēng)除濕,散瘀止血,平喘,殺蟲(chóng)止癢等作用。傳統(tǒng)應(yīng)用于治療腸炎腹瀉。痢疾,黃疸型肝炎,尿路感染和結(jié)石,腎炎,小便不利,尿血,血崩,白帶,濕疹,蕁麻疹,瘡癰腫毒,瘡瘍久不收口等癥。同時(shí)也用于治療各型肝炎,是民間常用的保肝治肝藥物,但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究尚未深入報(bào)道。
　　 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,紅背葉根中含生物堿和酚性物質(zhì),具有止咳、祛痰作用,抗乙酰膽堿作用和輕度抑制金黃色與白色葡萄球菌作用。本課題組首次發(fā)現(xiàn)其水

9、提物及水提醇沉所得的浸膏具有抗肝炎病毒和阻止肝纖維化的作用,有保肝、降酶、抗肝纖維化作用。體外實(shí)驗(yàn)研究表明有一定的抗乙肝病毒的作用?？锅喴腋尾《驹囼?yàn)表明紅背葉根有抑制體內(nèi)D-HBV復(fù)制的作用,作用與劑量和用藥時(shí)間相關(guān)。其作用較拉米夫定弱,但維持時(shí)間長(zhǎng)、服藥安全。課題組研究了紅背葉根對(duì)卡介苗和脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用,結(jié)果表明紅背葉根可顯著改善免疫性損傷小鼠胸腺、肝臟、脾臟系數(shù),降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、一氧化氮的活性

10、以及肝組織勻漿中TNF-α、IL-1β的含量,提示紅背葉根對(duì)免疫性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。上述實(shí)驗(yàn)表明,紅背葉根是一個(gè)較為理想的多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)治療乙肝的候選藥物。但經(jīng)文件檢索發(fā)現(xiàn)目前對(duì)紅背葉根的研究并不多。
　　 目的:本課題組通過(guò)不同的提取方法對(duì)紅背葉根進(jìn)行提取,并比較不同提取方法所得的生物堿的含量,從中找到提取紅背葉根生物堿中的最佳提取方法,并從中分離得出生物堿。同時(shí)比較不同提取方法的提取物對(duì)肝損傷的保護(hù)作用,對(duì)紅

11、背葉根總生物堿對(duì)四氯化碳所致的急性肝損傷的作用進(jìn)行初步研究,以了解紅背葉根中的有效成分,進(jìn)而為其進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.紅背葉根不同成分的提取
　　 1.1 粉碎:除去泥沙雜質(zhì)后,將紅背葉根粉碎成粗粉,備用。
　　 1.2 水提:取紅背葉根原藥材加8倍量水,加熱回流2小時(shí),收集提取液。殘?jiān)偌?倍量水加熱回流2小時(shí),過(guò)濾,合并提取液,蒸去多余水份,濃縮,冷藏備用。

12、r>　　 1.3 醇提:取紅背葉根原藥材加8倍量95％乙醇,加熱回流2小時(shí),收集提取液。殘?jiān)偌?倍乙醇加熱回流2h,過(guò)濾,合并提取液,回收乙醇后,冷藏備用。
　　 1.4 生物堿的提取:采用酸水.堿化.親脂性溶劑萃取,最終得到總生物堿。按與原藥材的比例配置成一定濃度混懸水液。生物堿中、低劑量組分別用混懸液加蒸餾水稀釋成1/2、1/4劑量,冷藏備用。
　　 2.紅背葉根不同提取物對(duì)四氯化碳致急性肝損傷小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

13、r>　　 2.1 實(shí)驗(yàn)分組昆明種小鼠96只,體質(zhì)量18～22 g,雌雄各半(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。采用隨機(jī)分組的方法分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯組(175mg/kg)、紅背葉根水提物(7.8g生藥/kg)、紅背葉根醇提物(7.8g生藥/kg)及紅背葉根總生物堿高(7.8g生藥/kg)、中(3.9g生藥/kg)、低(1.95g生藥/kg)劑量組,每組12只,雌雄各半。除正常組小鼠外,其余小鼠在造模的同時(shí)灌胃給藥,灌胃劑量為0.

14、5m/20g,正常組小鼠給同等劑量生理鹽水。
　　 2.2 造模方法連續(xù)灌胃給藥5 d,第5天給藥后1 h,采用腹腔注射0.12％四氯化碳(用橄欖油配制)O.1ml/10 g,正常組小鼠腹腔注射相同體積的橄欖油,禁食不禁水16小時(shí)。
　　 2.3 指標(biāo)檢測(cè)
　　 2.3.1 摘眼球采血后,離心獲得血清,按試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)血清ALT、AST、T.Bili活性。
　　 2.3.2 肝臟組織病理學(xué)檢查:處死動(dòng)

15、物,取出肝臟,用冷生理鹽水洗去浮血,拭干。于肝門處及右肝葉取材1塊,用10％中性福爾馬林溶液固定,70％、80％、90％、95％、100％乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機(jī)作4um切片,常規(guī)脫蠟,HE染色,中性樹(shù)膠封片。用顯微鏡觀察,以及PM-20型顯微攝像系統(tǒng)照相。
　　 2.4 統(tǒng)計(jì)處理方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,方差齊性時(shí),組間比較用One-Way ANOVA。采用LSD方法進(jìn)行組間多重比較；方差不齊時(shí),用We

16、lch法,采用DunnettT3方法進(jìn)行組間多重比較。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以((X)±s)表示,P<0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用不同提取方法對(duì)紅背葉根成分進(jìn)行提取,并比較所得的生物堿的含量,最終得出的結(jié)果為:采用水提法和醇提法所提取得到的生物堿的量約為0.06％,采用醇提法,提取所得生物堿含量稍高些。采用水提法,提取出來(lái)的其他非生物堿成分較多,分離生物堿比較麻煩。所以提

17、取生物堿的較佳途徑為醇提法。
　　 2.與正常組比較,模型組血清ALT、AST水平升高(P<0.05),表明本次實(shí)驗(yàn)的小鼠急性肝損傷造模成功。紅背葉根水提物、醇提物及總生物堿高、中、低劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比較,模型組小鼠血清中膽紅素水平升高(P<0.05),各給藥組與模型組比較,血清膽紅素的活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.小鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察,鏡下觀察各組小

18、鼠肝臟的病理變化。模型組小鼠肝細(xì)胞改變明顯,部分肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞有不同程度的壞死灶伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分可見(jiàn)體積增大,呈空泡片狀病變,與正常組相比有顯著性差異,提示造模成功。陽(yáng)性藥聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細(xì)胞基本正常,僅見(jiàn)部分輕度腫脹,未見(jiàn)壞死灶。紅背葉根水提物組、醇提物組、總生物堿高劑量組肝細(xì)胞輕度腫脹,未見(jiàn)壞死灶。總生物堿中劑量組肝細(xì)胞輕度腫脹,有點(diǎn)狀壞死。低劑量組肝細(xì)胞腫脹明顯,伴有散在點(diǎn)狀壞死。紅背葉根三種提取物組與模型組相比較