皺皮木瓜多糖的制備及抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥理活性研究.pdf

1、皺皮木瓜為薔薇科(Rosaceae)木瓜屬（Chaenomeles）皺皮木瓜Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實。皺皮木瓜是傳統(tǒng)中藥，用藥歷史可追溯到公元前401年(B.C401)。皺皮木瓜果實性溫、味酸，調(diào)營味、助谷氣，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功效，用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、轉(zhuǎn)筋攣痛等癥狀。皺皮木瓜含有豐富的酚酸、皂苷、黃酮、維生素、氨基酸、果膠、礦物質(zhì)等成分。藥理實驗研究顯示，皺皮木

2、瓜具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、免疫調(diào)節(jié)等活性。多糖因具有多種藥理活性，是近年研究的熱點，而目前對皺皮木瓜多糖類高分子研究報道較少。本課題首先探討了皺皮木瓜多糖的提取工藝，制備了皺皮木瓜多糖，利用體外細(xì)胞模型進(jìn)行了抗炎活性的初步研究，進(jìn)一步采用多種動物模型確證了皺皮木瓜多糖抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理活性，在此基礎(chǔ)上采用活性追蹤評價的方式分離、純化皺皮木瓜多糖的活性部位及活性組分。主要研究內(nèi)容具體如下:
　　一、皺皮木瓜多糖的制

3、備苯酚濃硫酸法測定皺皮木瓜多糖含量的方法學(xué)適用性研究:精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率均符合要求。通過L9(34)四因素三水平正交實驗設(shè)計研究了皺皮木瓜多糖的水回流提取的最佳工藝條件。以多糖提取率為評價指標(biāo)，得到最佳提取工藝條件為:提取時間為2h，提取次數(shù)為3次，液料比為12∶1(mL∶g)，在此工藝條件下，皺皮木瓜藥材中多糖的提取率為83.33％。水提液濃縮至1.5∶1(mL∶g)，80％乙醇醇沉24h，15％三氯乙酸除蛋白后，多糖得率為1

4、2.70％，多糖純度達(dá)到52.97％。
　　二、皺皮木瓜多糖體外抗炎活性的評價采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，確定了藥物的安全使用劑量范圍。結(jié)果顯示CFP在0～200mg/L濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活力不受影響。因此，實驗中CFP的使用劑量均在此范圍內(nèi)。在LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的體外炎癥模型中，CFP在50～200mg/L范圍內(nèi)能降低細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β、COX-2炎癥因子，也能降低細(xì)胞內(nèi)NO水平，且呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　三、皺皮木

5、瓜多糖抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥理活性研究在完全弗氏佐劑引起的大鼠足腫脹實驗中，CFP給藥劑量12.5～50mg/kg時，能抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的原發(fā)性的足腫脹，對原發(fā)性足腫脹的抑制作用與劑量呈正相關(guān)，最大腫脹抑制率分別為21.38％、31.03％和33.10％。對繼發(fā)性足腫脹的抑制作用與劑量呈正相關(guān)，最大腫脹抑制率依次為24.39％、41.46％和51.11％。病理學(xué)檢查結(jié)果表明:CFP能夠有效抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增生、浸潤的炎性細(xì)胞，從而減弱

6、關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)，阻礙了關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨組織、骨組織以及周圍關(guān)節(jié)組織的破壞。CFP各劑量組給藥后實驗動物體重前后未出現(xiàn)明顯的降低，說明了CFP在實驗動物的體內(nèi)毒性較低。
　　CFP在給藥劑量12.5～50mg/kg時，對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的腫脹值沒有明顯的抑制作用（P＞0.05），但有一定的抑制趨勢。CFP在給藥劑量25～100mg/kg時，CFP均能降低冰醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，抑制率分別為11.40％、22.79％及49.

7、57％。各組的扭體抑制作用大小為:CFP高劑量50 mg/kg組＞阿司匹林組＞CFP中劑量25mg/kg組＞CFP低劑量12.5mg/kg組。在25～100mg/kg劑量范圍內(nèi)，CFP隨著劑量的增加對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的抑制率逐漸升高，分別為28.5％、44.9％和52.8％。中、高劑量組與模型組比較差異均具有顯著或非常顯著的意義（P＜0.05或P＜0.01），對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的抑制作用均高于陽性對照組阿司匹林。在

8、內(nèi)皮網(wǎng)狀吞噬細(xì)胞的體液免疫實驗中，CFP各個給藥劑量組的抗體積數(shù)均與陽性對照組存在顯著性差異（P＜O.01），隨著CFP給藥劑量的加大，其抗體積數(shù)逐漸降低，但該作用低于環(huán)磷酰胺。在非特異性體液免疫實驗中，CFP劑量組的吞噬指數(shù)均低于陰性對照組，其中、高劑量與陰性對照差異最為顯著，CFP對小鼠非特異性免疫作用有明顯的抑制作用，可顯著地抑制吞噬功能。
　　四、皺皮木瓜多糖的分離純化皺皮木瓜多糖的粗分選用了纖維素離子交換樹脂，即DEAE

9、-650M型纖維素離子交換樹脂。將皺皮木瓜多糖分為水、0.1mol/L和0.2mol/L氯化鈉三個洗脫部位。體外LPS誘導(dǎo)的炎癥模型對洗脫部位進(jìn)行活性追蹤篩選結(jié)果顯示:水部位與0.1mol/L氯化鈉溶液洗脫部位有較好的抗炎效果，0.2mol/L NaCl洗脫部位無明顯活性。其中對活性部位多糖采用Sephacryl S系列進(jìn)行再一次的純化，此實驗過程還在進(jìn)一步的持續(xù)進(jìn)行中。
　　綜上，皺皮木瓜多糖有較好的抗炎活性和鎮(zhèn)痛功能，可用來治