溫熱療法與口服碘化鉀溶液對孢子絲菌病模型小鼠表皮朗格漢斯細胞的影響.pdf

1、目的:
　　 孢子絲菌病是由于感染申克氏孢子絲菌而引起的一種皮膚、皮下組織及其附近淋巴管慢性、化膿性炎癥的深部真菌病。目前，碘化鉀溶液仍為治療本病的首選藥物，但因部分患者對碘化鉀過敏或合并有肺結核，影響了部分人群在臨床上的應用。溫熱療法是一種有效的替代輔助療法，可以通過增強局部皮膚免疫促進皮損消退，適用于一些不能應用口服藥的孢子絲菌病患者，如孕婦、肝腎功能受損者及藥物過敏者，其臨床實施方便，無創(chuàng)傷，痛苦小，患者易于接受。

2、　　 局部溫熱治療的作用機制目前尚不明確。但腫瘤熱療方面及目前對感染性皮膚病的治療研究結果均發(fā)現，溫熱可以增強機體的免疫功能。表皮朗格漢斯細胞(Langerhans Cell，LC)是樹突狀細胞家族的一員，常駐于表皮，為皮膚內主要的抗原提呈細胞。表皮朗格漢斯細胞在誘導皮膚免疫反應中發(fā)揮非常重要的作用，它們能夠捕獲加工皮膚中遇到的抗原，并在轉移至局部引流淋巴結的過程中將其表達在MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子中，在那里將抗原提呈給效應T細胞，從而啟

3、動適應性免疫應答，朗格漢斯細胞的遷移在皮膚免疫反應中起著關鍵性作用。
　　 本實驗利用溫熱治療設備及碘化鉀溶液對感染孢子絲菌病的小鼠進行治療，觀察小鼠兩種治療后表皮內朗格漢斯細胞數量的影響，從局部免疫功能變化角度探討熱療的作用機制。
　　 實驗材料和方法:
　　 一、孢子絲菌病模型小鼠皮損周圍表皮LC與正常皮膚處表皮LC的比較:
　　 1、材料
　　 申克孢子絲菌菌株(CMU14034)來自中國醫(yī)

4、科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，為局限型皮膚型孢子絲菌病患者的分離株。
　　 昆明雌性小鼠，周齡8-10周，體重20-22克，10只，于背部皮下注射菌懸液約0.1ml（濃度約1×108個/ml），建立孢子絲菌病小鼠模型，約兩周出現皮損。
　　 2、方法
　　 將小鼠麻醉、背部脫毛，剪取面積為1.0×1.0cm的皮膚（感染小鼠取皮損周圍未破壞皮膚及遠端正常皮膚）。將剪取的皮膚放入EDTA分離液(PH=7.2)中，37℃恒

5、溫箱恒溫2小時，取出皮片，在解剖顯微鏡下分離真表皮。采用免疫組織化學的方法染色表皮內LC。光學顯微鏡下觀察LC，細胞膜和（或）細胞質呈棕褐色樹突狀細胞為LC，于20倍光鏡下每張片隨機選取6個非連續(xù)視野，計數方格內的陽性細胞數，計算出單位面積內細胞的密度，數據以中位數的形式表示。
　　 3、統計學處理
　　 采用SPSS17.0和Graphpad5.0軟件包進行統計分析和圖形制作，所有數據以中位數表示，兩組間實驗指標的比較

6、采用Mann-Whitney U檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，P＜0.05為有統計學意義。
　　 二、溫熱療法、碘化鉀溶液治療孢子絲菌病模型小鼠LC的比較
　　 1、材料
　　 申克孢子絲菌菌株(CMU14034)來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，為局限型皮膚型孢子絲菌病患者的分離株。
　　 昆明雌性小鼠，周齡8-10周，體重20-22克，30只，于背部皮下注射菌懸液約0.1ml（濃度

7、約1×108個/ml），建立孢子絲菌病小鼠模型，約兩周待出現皮損后隨機分為對照組、碘化鉀組和熱療組，每組10只。
　　 2、方法
　　 熱療組接種兩周后采用遠紅外局部溫熱治療儀局部加熱小鼠皮損，溫度41-43℃，20分鐘/次，隔日一次，皮損恢復正常后停止。碘化鉀組給予10％碘化鉀溶液，給藥方式:碘化鉀溶液根據小鼠平均每日飲水量（4-6ml/只）配制成0.24％水溶液代替飲用水（相當于人體用量的30ml/天）。對照組接種后

8、不予任何處置。治療開始即觀察治療反應，如，皮損大小變化;炎癥反應強度。治療后皮損消退即進行表皮朗格漢斯細胞計數（計數方法同上）并做皮損真菌培養(yǎng)，真菌培養(yǎng)陰性作為治療有效;同時比較兩種治療方法皮損消退所需治療時間。
　　 3、統計學處理
　　 所得數據用應用SPSS17.0和Graphpad5.0軟件包進行統計分析和圖形制作，所有數據以中位數表示，兩組間實驗指標的比較采用Mann-Whitney U檢驗相關性分析采用Spe

9、arman秩相關檢驗，P＜0.05為有統計學意義。
　　 結果:
　　 一、孢子絲菌病模型小鼠皮損周圍表皮LC與正常皮膚處表皮LC的比較:
　　 孢子絲菌病模型小鼠正常表皮內朗格漢斯細胞分布較均勻，有較多的樹突，孢子絲菌病皮損周圍表皮內朗格漢斯細胞變圓、變小，樹突數量減少甚至消失、長度變短。孢子絲菌病皮損周圍表皮內朗格漢斯細胞數目較正常表皮內朗格漢斯細胞分布密度明顯下降，有顯著性差異(P=0.0005)。

10、　　 二、溫熱療法與碘化鉀溶液治療孢子絲菌病模型小鼠療效表皮LC的比較:
　　 1、溫熱療法與碘化鉀溶液治療孢子絲菌病模型小鼠治療時間的比較:
　　 接種后一周左右出現皮損。第二周、第三周皮損最為顯著，主要變現為接種處紅腫、結節(jié)、潰瘍、溢膿及結痂。伴隨著治療次數增加，熱療組及碘化鉀組小鼠皮損處紅腫消退、潰瘍愈合及痂皮脫落均較對照組快，且溫熱組小鼠皮損干燥結痂較碘化鉀小鼠時間短。治療結束后熱療組小鼠接種處活檢真菌培養(yǎng)9只

11、為陰性，1只為陽性;碘化鉀組小鼠治療結束后皮損活檢真菌培養(yǎng)結果7只為陰性，3只為陽性;對照組接種后四十天真菌培養(yǎng)9只均為陽性，1只為陰性。
　　 2、溫熱療法與碘化鉀溶液治療孢子絲菌病模型小鼠表皮LC數量的比較:
　　 溫熱組小鼠皮損周圍表皮內LC密度較感染組明顯下降(P＜0.001)，碘化鉀組小鼠皮損周圍表皮內LC密度較感染組無顯著差異(P=0.3256)，溫熱組小鼠皮損周圍表皮內LC密度下降較碘化鉀組小鼠更為明顯，差

12、異有統計學意義(P=0.0002)。
　　 結論:
　　 通過我們的研究觀察，得出以下結論:
　　 孢子絲菌病小鼠模型有自愈傾向。
　　 孢子絲菌感染可以影響表皮內LC從而調動皮膚的免疫功能，感染孢子絲菌病的小鼠表皮內LC密度較正常表皮內LC密度明顯下降。
　　 溫熱療法治療孢子絲菌病模型小鼠有效，小鼠表皮受到溫熱刺激作用后，表皮內LC數量下降，LC形態(tài)發(fā)生改變;口服碘化鉀溶液治療后孢子絲菌病模型