水稻miRNAs靶基因驗(yàn)證瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、MiRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)剪切靶基因mRNA或抑制蛋白的翻譯調(diào)控真核生物的基因表達(dá)。在植物體內(nèi)，miRNAs主要參與了生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫反應(yīng)等多種生物進(jìn)程。隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量新的miRNAs，miRNA database已經(jīng)收錄了38589個(gè)miRNAs，然而大多數(shù)miRNA的生物功能及其靶基因仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究miRNA的作用，關(guān)鍵是研究miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控。MiRNAs靶基因的驗(yàn)證

2、常用方法包括Northern Blot，Western Blot，降解組測(cè)序(Degradome sequencing)，MirTrap，RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNAs靶基因，采用不同的方法和不同的參數(shù)條件都可能會(huì)得到不同的靶基因，預(yù)測(cè)結(jié)果存在假陽(yáng)性和假陰性，因此，對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也是必需的。鑒于miRNA靶基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)程較為復(fù)

3、雜、耗時(shí)，因此，建立一種準(zhǔn)確且快速地預(yù)測(cè)和驗(yàn)證miRNA靶基因的方法對(duì)研究miRNA的生物學(xué)功能具有非常重要的意義。利用瞬時(shí)表達(dá)結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因建立的檢測(cè)系統(tǒng)是靶基因驗(yàn)證的一種快速、簡(jiǎn)便的方法。本文利用農(nóng)桿菌所介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)合水稻原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)，系統(tǒng)研究了不同體系下miRNAs的動(dòng)態(tài)表達(dá)，以及靶基因驗(yàn)證的最佳體系。主要結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建了適用于水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的載體，將miR169o過(guò)表達(dá)載體分別與LU

4、C空白載體，靶基因LOC_Os03g48970.1與LUC的融合載體（后稱作LUC-48970）以及LUC-48970m3（及48970突變載體）共轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中，miR169o和LUC-48970共轉(zhuǎn)化后的LUC活性顯著弱于miR169o和空白融合載體(LUC)共轉(zhuǎn)化，miR169o和LUC-48970m3（即48970的突變）共轉(zhuǎn)化后的LUC活性，表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而水

5、稻原生質(zhì)體系統(tǒng)可以用于miRNAs靶基因的檢測(cè)。
　　(2)在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后12h，18h，24h，36h分別檢測(cè)LUC活性，發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)，LUC的活性最高，表明24h可能是最適宜觀察熒光的時(shí)期。此外，還利用qRT-PCR檢測(cè)了這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)成熟miR169o的表達(dá)量，整體來(lái)看，miR169o的表達(dá)量與轉(zhuǎn)化時(shí)間具有正相關(guān)性，12h表達(dá)量最低，在24h表達(dá)量上調(diào)至十倍。當(dāng)將miR169o與靶基因融合載體共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后，在不同的

6、處理中miR169o的表達(dá)具有一定的差異。綜合miRNAs表達(dá)水平及LUC活性的檢測(cè)結(jié)果，建議在miRNAs靶基因的驗(yàn)證中，水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后24h-36h作為后續(xù)最適宜的檢測(cè)時(shí)間。
　　(3)構(gòu)建了適用于煙草瞬時(shí)表達(dá)的載體，將攜帶miR169o過(guò)表達(dá)載體與LUC空白載體，LUC-48970融合載體，LUC-48970m3載體的農(nóng)桿菌分別共注射到煙草葉片中，檢測(cè)LUC活性，發(fā)現(xiàn)miR169o與LUC-48970共表達(dá)中的LUC活性

7、明顯弱于miR169o與LUC共表達(dá)，miR169o與LUC-48970m3共表達(dá)中的LUC活性，表明煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以用于水稻mRNAs的靶基因驗(yàn)證。注射煙草48h，72h，96h檢測(cè)LUC活性，發(fā)現(xiàn)72h LUC活性達(dá)到高峰后，又有所降低，表明72h是農(nóng)桿菌注射后最適宜的檢測(cè)點(diǎn)。此外，利用qRT-PCR檢測(cè)了注射后24h，36h，48h，72h成熟miR169o表達(dá)量，24h表達(dá)量最低，48h時(shí)表達(dá)量已顯著上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)達(dá)到近二

8、十倍。綜合這兩方面的檢測(cè)結(jié)果，建議在miRNAs靶基因驗(yàn)證體系中，煙草注射菌后48h-72h作為后續(xù)最適宜的檢測(cè)時(shí)間。
　　(4)利用構(gòu)建的水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，檢測(cè)了miR812g與其預(yù)測(cè)靶基因LOC_Os02g07960.4和LOC_Os04g47140.1，miR5076與其預(yù)測(cè)靶基因LOC-Os02g27594.2，miR818a與其預(yù)測(cè)靶基因LOC_Os09g36320.1，miR169o與其預(yù)測(cè)靶