維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPr-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法.pdf

1、在細菌以及古細菌中廣泛存在規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR，clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統(tǒng)，是細菌在長期進化過程中形成的由RNA介導(dǎo)降解入侵菌體的噬菌體等外源核酸的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。近年來研究表明，CRISPR系統(tǒng)可以很好地被改造成基因編輯工具。通過設(shè)計引導(dǎo)RNA招募Cas蛋白對靶位點進行識別切割，激活菌體內(nèi)部的同源重組(Hom

2、ologous recombination，HR)修復(fù)機制，與設(shè)計好的編輯模板進行交換以實現(xiàn)基因編輯。
　　維吉尼亞鏈霉菌IBL14（Streptomyces virginiae IBL14）是本實驗室從制藥廠附近的活性泥污中分離得到的一株能降解多種甾體化合物的放線菌。本研究通過對IBL14的全基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在IBL14中也存在CRISPR系統(tǒng)。其中存在18個CRISPR位點，其中3個是確定的位點，其他都是有疑問的位點。

3、
　　通過蛋白比對發(fā)現(xiàn)在SV01和SV02兩個CRISPR位點之間存在著一個由7個Cas蛋白基因組成的蛋白群分別是cas6，DevR（cas7），cas5，cas3，cas4，cas1，cas2。
　　根據(jù)對cas1的比對以及Cas蛋白的排列，確定了中的CRISPR系統(tǒng)屬于I-B型并將其命名為CRISPR I-SV14B系統(tǒng)。
　　本研究以IBL14中svu016基因為靶基因，根據(jù)I-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)特點，

4、選取TAC堿基序列作為打靶序列PAM位點。選取設(shè)計一段引導(dǎo)DNA以及同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化到IBL14中進行打靶，實驗結(jié)果表明svu016基因成功地被敲除掉。同時另一方面利用傳統(tǒng)的敲除方式對svu016基因進行敲除，設(shè)計帶有氯霉素抗性基因的同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上轉(zhuǎn)化到IBL14中，經(jīng)過大量篩選結(jié)果僅獲得一個敲除菌株。實驗結(jié)果表明，利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進行基因編輯的效率在70％以