新型納米生物螺釘及生物股骨髁的制備與相關實驗研究.pdf

1、第一部分、納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維材料的制備及其對成骨細胞生物學行為的影響
　　目的：研究納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維（nano-hydroxyapatite/polyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）復合材料的細胞相容性及其對MC3T3-E成骨細胞生物學行為的影響，為后期應用提供實驗依據。
　　方法：
　　制備圓片狀n-HA/PA66/GF材料并按照ISO10993標

2、準制備其浸提液。取MC3T3-E1成骨細胞，分別與圓片狀材料或其浸提液共培養(yǎng)。通過直接接觸實驗、掃描電鏡觀察及CCK-8法檢測該材料對成骨細胞黏附、生長、增殖的影響;通過BCA法檢測材料對成骨細胞總蛋白合成的影響;通過酶聯免疫吸附測定法檢測材料對成骨細胞骨鈣素分泌的影響;通過流式細胞術檢測材料浸提液對成骨細胞周期的影響;通過AnnexinV-FITC/PI雙標記法檢測材料對細胞凋亡的影響;通過Transwell小室遷移實驗檢測材料對成骨

3、細胞遷移的影響;通過雙標記間接細胞免疫熒光染色在激光共聚焦儀上觀察材料及其不同濃度的浸提液對細胞骨架及肌動蛋白纖維分布的影響。
　　結果：
　　直接接觸實驗表明n-HA/PA66/GF材料對MC3T3-E1細胞無明顯細胞毒性。材料周圍的細胞生長旺盛，為長梭形，無空泡及細胞皺縮，貼壁生長良好。CCK-8實驗顯示細胞數量隨著培養(yǎng)時間延長而增多，實驗組與兩對照組之間的差異在共培養(yǎng)前5天無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，在培養(yǎng)7天后實驗

4、組細胞數量較陰性和陽性對照組多(p＜0.05)。實驗組與對照組細胞總蛋白含量分別為(2.21±0.48)mg/ml、(1.68±0.25) mg/ml，BCA法檢測證實材料能促進成骨細胞總蛋白的合成，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。流式細胞檢測結果證實材料能使更多細胞進入S期而對細胞凋亡率無明顯影響。兩組細胞的凋亡率分別為7.93％±2.37％、8.31％±2.84％，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。Elisa檢測的兩組細胞

5、分泌的骨鈣素含量在共培養(yǎng)1、3、5、7天時差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，但在共培養(yǎng)10、14天后材料能促進成骨細胞分泌骨鈣素(p＜0.05)。Transwell遷移實驗顯示穿膜細胞數兩組之間無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。掃描電鏡觀察見材料表面的成骨細胞形態(tài)規(guī)整呈長梭形，細胞之間緊密相連并通過偽足緊緊黏附在材料表面，隨著培養(yǎng)時間延長逐漸呈現復層生長。免疫熒光結果表明不同濃度的材料浸提液對細胞骨架及肌動蛋白纖維的極性分布無明顯影響，n-

6、HA/PA66/GF材料具有良好的細胞相容性，能為細胞的粘附與增殖提供適宜的環(huán)境。
　　結論：
　　新型n-HA/PA66/GF復合材料具有良好的成骨細胞相容性，對細胞生長、增殖、分泌、黏附、周期和遷移等行為均有一定調節(jié)作用。
　　第二部分、納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維生物活性螺釘固定犬股骨髁間骨折的實驗研究
　　目的：評估納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維（nano-hydroxyapatite/po

7、lyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）生物螺釘的體內生物相容性、內固定性能及骨傳導性能，為后期臨床推廣應用提供實驗依據。
　　方法：
　　通過注塑成型方法制備n-HA/PA66/GF生物活性螺釘。使用掃描電鏡觀察、能譜分析、X射線衍射分析及紅外圖譜分析對材料進行表征。取24只成年中華田園犬，隨機分為兩組:生物螺釘實驗組和金屬螺釘對照組。所有動物均造股骨髁間骨折，分別使用生物螺釘及金屬螺釘固定骨折

8、。于術后4、8、12、24周行大體觀察、硬組織學切片染色檢測、CT+3D影像學檢測、三點彎曲生物力學測試及血常規(guī)、生化檢測，術后24周處死動物后取肝臟、腎臟、脾臟行組織學檢測。
　　結果：
　　掃描電鏡觀察顯示涂層在螺釘表面分布均勻，涂層與基體材料之間無相分離，結合緊密，融合為一體。涂層粒子為納米級別，呈片狀或葉狀。EDS能譜分析結果顯示涂層的主要成分為Ca和P元素，表明涂層組成為n-HA。X射線衍射(XRD)分析顯示2θ=

9、31.82°，32.90°，34.25°，38.38°，46.70°，49.52°和53.15°屬于羥基磷灰石的晶格特征峰，2θ=20.38°，23.49°為聚酰胺(PA)晶格的主峰。紅外圖譜分析(FTIR)發(fā)現3442cm-1處寬而強的吸收峰為對應羥基(-OH)振動吸收峰，960cm-1處的吸收峰對應PO43-對稱伸縮振動吸收峰，605cm-1和565cm-1吸收峰對應PO43-的彎曲振動，1102cm-1和1037cm-1處的吸收峰

10、對應PO43-的非對稱伸縮振動吸收峰。動物實驗證實兩種螺釘均能有效地固定犬髁間骨折，術后觀察兩組動物均正?；顒?，切口愈合良好。術后12周CT檢測顯示兩組動物髁間骨折均已骨性愈合。組織學檢測發(fā)現n-HA/PA66/GF螺釘表面被新生骨覆蓋且新生骨不斷鈣化、成熟，骨與生物螺釘結合緊密。金屬螺釘與骨之間存在較大間隙，螺釘周圍骨組織被一層纖維組織包裹。Micro-CT檢測結果顯示使用兩種螺釘固定骨折12周后均發(fā)生骨性愈合。生物螺釘周圍較金屬螺釘

11、周圍有更多的新生骨小梁形成，生物螺釘與周圍的新生骨融為一體。生物力學測試證實兩組最大推出載荷在術后4、8、12周無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，但在術后24周有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，推出生物螺釘所需的最大載荷比對照組大。術后24周實驗動物靜脈血中堿性磷酸酶水平升高[(58.8±14.49)U/L]，檢測的血常規(guī)、生化各數值均正常。肝、脾、腎HE染色未見結構正常，表明材料無明顯的器官毒性。
　　結論：
　　n-HA/PA6

12、6/GF生物活性螺釘具有良好的體內相容性，內固定性能和促進新骨形成、成熟性能，具有廣闊的應用前景。
　　第三部分、聚氨酯/納米羥基磷灰石/聚酰胺66修復犬股骨髁缺損的實驗研究
　　目的：評估復合材料聚氨酯/納米羥基磷灰石/聚酰胺66(polyurethane/nano-hydroxyapatite/Polyamid66，PU/n-HA/PA66)修復犬股骨髁缺損的能力。
　　方法：
　　制備PU/n-HA/PA6

13、6復合材料并按照犬股骨髁實際大小加工成型為生物股骨髁。掃描電鏡觀察材料表面情況并測定其孔隙率。取16只成年中華田園犬，按隨機數字表分為兩組:PU/n-HA/PA66生物股骨髁實驗組和自體股骨髁對照組。使用電鋸將犬股骨外髁鋸斷造股骨髁缺損模型，分別使用生物股骨髁及自體股骨髁修復缺損。術后4、8、12、24周行大體觀察、組織學檢測、免疫組化染色、CT影像學檢測及血常規(guī)、生化檢測，術后24周行肝、腎、脾組織學檢測。
　　結果：
　

14、　經測定，材料孔隙率為80.89％±5.01％?？讖街饕植荚?00μm～800μm之間，孔壁上有與相鄰孔貫通的100μm～300μm微孔。術后2組動物均活動正常，切口愈合良好。CT影像見實驗動物的PU/n-HA/PA66股骨髁與自體股骨內髁緊密鍵合，材料無降解，假體與脛骨平臺、股骨內髁及髕骨的關節(jié)面匹配良好，內外側膝關節(jié)間隙無狹窄且基本對稱。組織學檢測顯示兩組股骨髁假體均與自體骨結合緊密，生物股骨髁網孔中的骨小梁逐漸增多成熟。免疫組化