引起葡萄皺木復(fù)合癥的兩種線形病毒的分子特性研究.pdf

1、葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)和葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)在葡萄上引起莖溝病和栓皮病,這兩種病害均為葡萄皺木復(fù)合癥之一,對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅。GVA和GVB在國(guó)內(nèi)早有報(bào)道,但我國(guó)對(duì)其開(kāi)展研究較晚,尚處于起步階段。本研究從病毒檢測(cè)入手,對(duì)來(lái)源于我國(guó)鄭州國(guó)家葡萄種質(zhì)資源圃、湖北省果樹(shù)茶桑研究所、中科院果樹(shù)研究所的74份葡萄樣品進(jìn)行了病毒檢測(cè)；對(duì)得到的GVA中國(guó)分離物進(jìn)行了組群鑒別,并

2、基于GVA外殼蛋白(Coat protein,CP)基因,利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-strand conformation polymorphisms,SSCP)技術(shù)對(duì)我國(guó)GVA分離物分子變異及群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究；并對(duì)我國(guó)GVB分離物分子特性進(jìn)行了初步研究,取得的研究成果如下:
　　 1采用三夾心抗體ELISA(1Yiple antibody sandwich ELISA,TAS-ELISA)和反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(R

3、everse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)對(duì)來(lái)自于我國(guó)3個(gè)不同地區(qū)的共74份葡萄樣品分別進(jìn)行了GVA和GVB檢測(cè)。結(jié)果表明GVA檢出率高于國(guó)內(nèi)之前的報(bào)道。尤其是2008年采自鄭州的樣品,GVA檢出率高達(dá)82.8％,大大高于2002年同地區(qū)采集樣品4.5％的檢出率,由此推測(cè)造成GVA昆蟲(chóng)介體傳播是造成GVA大范圍發(fā)生的主要因?yàn)椤Ｏ啾扔贕VA的高檢出率,GVB則較低,最高的為

4、遼寧樣品檢出率為25％。
　　 2利用組群鑒別引物對(duì)所獲得的40個(gè)GVA分離物所屬的組群進(jìn)行了鑒定,表明所有的分離物均屬于組群Ⅰ和組群Ⅱ,沒(méi)有屬于組群Ⅲ的分離物。共克隆了14個(gè)GVA中國(guó)分離物的CP基因,全長(zhǎng)597 nt。并基于CP基因的克隆進(jìn)行了SSCP分析。根據(jù)有無(wú)優(yōu)勢(shì)單體型將SSCP圖譜分為兩種類型。對(duì)各分離物中代表不同單體型的克隆進(jìn)行測(cè)序,共得到114條GVA CP基因序列。遺傳距離分析表明,其中7個(gè)分離物含有高度變異的

5、分子變種,為混合侵染,證明我國(guó)GVA群體存在遺傳異質(zhì)性；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明GVA分離物可聚為三個(gè)分枝,分別代表了三個(gè)組群,其中組群Ⅰ可聚為兩個(gè)亞組群Ⅰ A和Ⅰ B。本研究所獲得的所有GVA分子變種均屬于組群Ⅰ,且大部分分子變種屬于亞組群Ⅰ A。由此推測(cè)在這三個(gè)地區(qū),屬于GVA亞組群Ⅰ A的變種為優(yōu)勢(shì)分子變種。
　　 3得到一個(gè)分子變種組成特殊的分離物AF?；旌锨秩镜?個(gè)分離物中有4個(gè)分離物包含的分子變種分別屬于兩個(gè)亞組群。除分離

6、物AF外,其余3個(gè)分離物中屬于亞組群Ⅰ A分子變種占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。而分離物AF中屬于亞組群Ⅰ B的分子變種頻率稍高于亞組群Ⅰ A的分子變種。
　　 4克隆了分離物羅查里奧和奇妙無(wú)核GVB基因組3'末端,包括完整的ORF5(Open reading frame)372-375 nt和3’末端非翻譯區(qū)(3'Un-translated region,3'UTR)154-151 nt序列。ORF5和3UTR核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明,這兩個(gè)分

7、離物親緣關(guān)系較近,而與國(guó)外報(bào)道的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 5克隆得到三個(gè)GVB分離物羅查里奧、藤稔和無(wú)核白雞心的全長(zhǎng)CP基因,大小為594 nt。序列分析表明,藤稔和無(wú)核白雞心分離物核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均為98.5％,推測(cè)可能是由介體傳播造成病毒傳播。核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,藤稔和無(wú)核白雞心分離物親緣關(guān)系很近,而羅查里奧分離物與四川SL10分離物及日本分離物親緣關(guān)系較近。氨基酸序列多重匹配分析發(fā)現(xiàn),藤稔和無(wú)核白雞心