基于熒光定量技術(shù)的微囊藻毒素預(yù)測(cè)性監(jiān)測(cè)方法研究.pdf

1、日趨嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的水華現(xiàn)象已成為全球性的環(huán)境問題。水華形成的主要原因是由于水體中藻類的過度繁殖，其中的產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生的藍(lán)藻毒素蓄積在水中，嚴(yán)重威脅人們的飲水安全。藍(lán)藻毒素是由七個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽類物質(zhì)，一般稱為微囊藻毒素(Microcystins，MCYST)。微囊藻毒素通常以肝臟為靶器官，具有很強(qiáng)的致癌作用，人類和動(dòng)物長(zhǎng)期飲用含有微囊藻毒素的水可引起中毒及肝損傷，嚴(yán)重者甚至死亡。因此，加強(qiáng)對(duì)水體中藻毒素的監(jiān)控和檢測(cè)十分重要。<

2、br>　　常用的微囊藻毒素檢測(cè)方法有HPLC、LC—MS、GC—MS、ELISA、PPIA、TLC等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但其共同的不足之處在于均無法支撐微囊藻毒素預(yù)警性檢測(cè)體系的建立。微囊藻毒素是伴隨著微囊藻的生長(zhǎng)繁殖而產(chǎn)生的，其在水體中必然會(huì)有釋放與蓄積的規(guī)律。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，結(jié)合分子生物學(xué)方法，利用藻類細(xì)胞生長(zhǎng)過程中相關(guān)基因豐度變化與微囊藻毒素產(chǎn)生與積累之間的關(guān)聯(lián)性，實(shí)現(xiàn)毒素的預(yù)警和預(yù)測(cè)對(duì)于保證飲水安全將是十分必要的。

3、>　　微囊藻毒素合成酶基因簇由(mcyA—C)和（mcyD—J）兩個(gè)相鄰的但轉(zhuǎn)錄方向相反的大操縱子構(gòu)成，分別編碼聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)和非核糖體肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS），凡能產(chǎn)生微囊藻毒素的藻株均含有藻毒素合成酶基因簇。本課題對(duì)微囊藻毒素合成酶基因的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，為水華發(fā)生和微囊藻毒素的積累進(jìn)行預(yù)警性監(jiān)測(cè)提供了理論支撐。
　　首先，以

4、微囊藻藻細(xì)胞為對(duì)象，建立全細(xì)胞PCR檢測(cè)方法。以微囊藻毒素合成酶基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異性引物，建立不受其它藻類細(xì)胞或雜菌等外界環(huán)境因子干擾的藻毒素合成酶基因全細(xì)胞PCR檢測(cè)體系。方法具有操作簡(jiǎn)單快速，成本低，穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。在20ul反應(yīng)體系中，以5ul預(yù)處理的藻細(xì)胞為模板，檢測(cè)下限可達(dá)103cells/ml，適用于低藻濃度水樣中微囊藻產(chǎn)毒基因的檢測(cè)。
　　其次，為了對(duì)微囊藻產(chǎn)毒基因進(jìn)行定量，建立了針對(duì)微囊藻毒素合成酶基

5、因的熒光定量PCR檢測(cè)體系。以微囊藻毒素合成酶基因——mcyA、mcyB、mcyD、mcyH及微囊藻特異性16SrDNA部分核苷酸保守序列為靶基因設(shè)計(jì)合成特異性引物，SYBRGreenⅠ為熒光染料，構(gòu)建SYBRGreenⅠ熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR微囊藻毒素檢測(cè)體系。構(gòu)建兩個(gè)藻種株的人工體系，分別制備五個(gè)含產(chǎn)微囊藻毒素基因的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，選取103-108ng/ul六個(gè)稀釋度，每次反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照和三個(gè)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效。結(jié)果表明

6、:每個(gè)稀釋度的Ct值穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)較小，所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線初始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上，說明實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求。
　　最后，將以上構(gòu)建的微囊藻毒素實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系法用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的已知藻株及上海淀山湖水樣的檢測(cè)，并以高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比，結(jié)果一致。研究結(jié)果初步說明，本課題建立的監(jiān)測(cè)方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)。對(duì)于水樣中產(chǎn)毒微囊藻的檢測(cè)具有一定實(shí)