大腸不耐熱腸毒素B亞單位作為佐劑的分子機理研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素 B亞單位是一種非常有效的粘膜免疫佐劑，它能刺激機體產生強烈的粘膜和系統(tǒng)免疫應答。LTB通過與細胞表面的 GM1結合，不僅能增強機體對抗原的免疫應答效應，還能夠改變粘膜免疫應答的類型。LTB的免疫調節(jié)作用包括促進 Th1和 Th2型細胞反應的細胞因子的表達，CD8+ T細胞的凋亡和 CD4+ T細胞的增殖；使 B細胞活化的 MHCⅡ、ICAM-1、CD25、CD40分子表達增加，影響 B細胞和巨噬細胞的抗原處理和遞呈

2、過程。但在巨噬細胞的具體免疫機制尚不清楚，本文將在這方面進行研究。
　　目的：從 LTB處理的 RAW264.7細胞中，篩選與 LTB有相互作用的蛋白質分子，并通過生物信息學方法預測其與 LTB佐劑活性的相關性；并利用分子生物學技術對它們的相互作用進行驗證，最終探索LTB作為免疫佐劑的分子機理。
　　方法：(1)在大腸桿菌中誘導表達含 His-tag的 LTB融合蛋白，用鎳磁珠純化。(2)復性后的 LTB融合蛋白去除內毒素，

3、然后處理RAW264.7細胞。(3)提取 LTB處理后 RAW264.7細胞總蛋白，用pull down的方法，分離與 LTB有相互作用的蛋白分子。(4) PAGE檢測分離得到的蛋白分子，并收集該蛋白質進行質譜鑒定。(5)運用生物信息軟件從質譜鑒定結果中篩選出可能的相互作用蛋白分子，并對其進行功能性分析和信號通路分析，構建出這些蛋白分子相互作用的網絡圖，篩選出有意義蛋白分子。(6)免疫熒光驗證這些分子在細胞內與 LTB相互作用。(7)

4、Western blot檢測下游分子的表達。
　　結果：(1)通過pull down捕獲到與LTB有相互作用的蛋白分子，并通過質譜鑒定了這些蛋白分子。(2)通過對這些蛋白分子進行生物學分析后，篩選出 junction plakoglobin、heat shock protein1、carbamoyl-phosphate synthetase1、vimentin等25種有統(tǒng)計學意義的蛋白分子。(3)通過對25種蛋白分子進行功能及其信

5、號通路分析(3)免疫熒光結果顯示， Vimentin在生理狀態(tài)下不能與 LTB相互作用，而GM130在細胞內與LTB有相互作用，表明LTB在細胞內是以內吞小泡的形式運輸的。(4) Western blot檢測顯示， LTB處理RAW264.7細胞12 h后，β-actin表達上調，Hspd1表達無變化，表明LTB與Actb確實存在相互作用。
　　結論：通過質譜鑒定結果和免疫熒光實驗，我們可以推測 LTB通過與免疫細胞表面 GM1結