內(nèi)源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸對(duì)擬南芥生理影響及植物XB3-like蛋白家族功能研究.pdf

1、植物的固著性使它整個(gè)生命過程中不可避免面臨各種不利的外部環(huán)境（如干旱脅迫、鹽脅迫、澇害、高溫、低溫、病原菌侵襲等）。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物形成了一套響應(yīng)脅迫和提高抗性的機(jī)制。因此，理解植物應(yīng)答逆境脅迫傷害、適應(yīng)性變化等諸多生理過程，對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要意義。內(nèi)源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸對(duì)擬南芥生理影響
　　 VLCPUFAs(very long chain polyunsaturated fatty acids)對(duì)

2、人體營(yíng)養(yǎng)和健康非常重要。雖然人體自身能夠合成VLCP(UFAs，但其效率極低。目前，該類脂肪酸的主要來源是深海魚油，其主要有效成分是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。但由于過度捕撈、環(huán)境污染等諸多原因，導(dǎo)致魚油的供給已遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，許多生產(chǎn)超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因油料作物已誕生，如油菜，大豆和亞麻等。因此，研究這些異源脂肪酸在植物生理和對(duì)非生物脅迫的耐受性具有可行性。該研究將為轉(zhuǎn)基因植

3、物中商業(yè)化生產(chǎn)超長(zhǎng)連多不飽和脂肪酸奠定理論基礎(chǔ)。
　　 我們以內(nèi)源合成二十碳二烯酸(EDA)和二十碳三烯酸(ETrA)的轉(zhuǎn)IgASE1基因的擬南芥作為材料，結(jié)合外源添加實(shí)驗(yàn)，研究EDA和ETrA對(duì)擬南芥的生理表型及干旱脅迫的耐受性的影響。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 (1) RT-PCR分析表明，IgASE1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá);氣相色譜分析其葉片脂肪酸組成，結(jié)果表明:內(nèi)源合成的EDA和ETrA占總脂肪酸含量的25.

4、6mol％;葉片膜脂組成分析表明，EDA和ETrA參與了生物膜脂的構(gòu)成，從而將膜脂內(nèi)不飽和脂肪酸的含量由野生型的59.6mol％，增加到轉(zhuǎn)基因植株中73.7mol％。
　　 (2)連續(xù)多代擬南芥生長(zhǎng)表型調(diào)查結(jié)果表明，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥表型上有差異:苗期生長(zhǎng)緩慢，花較小且花瓣較薄，種子更飽滿，后熟時(shí)間縮短。
　　 (3)外源添加ABA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)，苗期生長(zhǎng)及氣孔的張開

5、方面對(duì)ABA的敏感性增強(qiáng)。
　　 (4)選用萌發(fā)后3天的幼苗和萌發(fā)后3周的苗子分別進(jìn)行模擬干旱和斷水處理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥對(duì)干旱的耐受能力強(qiáng)。利用qRT-PCR分析依賴于ABA途徑的關(guān)鍵基因（RD29B、RD26和CBF3）和非依賴于ABA途徑的關(guān)鍵基因（COR15A、ADH1和CBF2）的表達(dá)情況，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱的強(qiáng)耐受力來源于依賴ABA途徑和非依賴ABA途徑的共同作用。
　　 (5)

6、外源添加EDA和ETrA可以在野生型中模擬轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA敏感和對(duì)干旱耐受的表型，即EDA和ETrA在擬南芥對(duì)ABA和干旱的響應(yīng)過程中作用。植物XB3-like蛋白家族功能研究
　　 具有同源性結(jié)構(gòu)域及序列，進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)歸在同一個(gè)蛋白家族，對(duì)蛋白家族的分析研究有利于對(duì)該蛋白家族的功能及進(jìn)化進(jìn)行系統(tǒng)研究。隨著基因組測(cè)序的飛速發(fā)展，至今已有五十多種植物完成或正在進(jìn)行全基因組測(cè)序，這為在多個(gè)物種中分析比對(duì)一個(gè)蛋白家族提供可行

7、性。
　　 水稻XB3，是XA21絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，在XA21介導(dǎo)的抗病途徑中起到重要作用。在擬南芥中同源基因有5個(gè)，分別命名為XBAT31、XBAT32、XBA T33、XBAT34和XBAT35。對(duì)XBAT32和XBAT35的研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育及抗逆過程中起到重要作用。經(jīng)過我們對(duì)這些蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它們都包括錨定重復(fù)序列(ANK)和保守的C3HC4型指環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，我們將同時(shí)含有ANK和C3HC4指環(huán)結(jié)

8、構(gòu)的蛋白歸為一個(gè)蛋白家族，并命名為XB3-like蛋白家族。本研究利用生物信息學(xué)的方法分析比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的所有物種序列(29種)，對(duì)該蛋白家族的功能及進(jìn)化進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期找到具有合適功能的基因用于生產(chǎn)實(shí)踐。
　　 (1)我們利用生物信息學(xué)方法從己公布的29種全基因組測(cè)序的物種中搜索到187個(gè)同時(shí)具有ANK和C3HC4型指環(huán)結(jié)構(gòu)的蛋白。因其與XB3結(jié)構(gòu)上相似，我們命名為XB3-like蛋白家族，編碼這組蛋白的基因命名為XB3-l

9、ike基因家族。對(duì)29個(gè)物種中XB3-like基因的數(shù)量統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，兩種藻中無XB3-like基因，結(jié)果說明該蛋白家族在植物進(jìn)化過程中可能是由蕨類開始出現(xiàn)的。
　　 (2)根據(jù)XB3-like蛋白間的同源性關(guān)系構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)該家族蛋白可分為三組，且三組蛋白的指環(huán)結(jié)構(gòu)域之間存在明顯差異。另外，我們還發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物中XB3-like蛋白分別屬于上述三組蛋白，而蓖麻和苜蓿中僅有2個(gè)XB3-like蛋白且都屬于第Ⅰ組。
　　 (

10、3)對(duì)模式植物擬南芥和三種作物（水稻、玉米和大豆）的芯片分析結(jié)果顯示，該基因家族在植物的整個(gè)生命周期和不同的組織中均有廣泛表達(dá)和偏好性表達(dá)，這個(gè)結(jié)果說明該家族基因可能在植物不同發(fā)育階段和不同組織發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。
　　 (4)我們利用熒光定量的方法檢測(cè)到擬南芥和玉米中多個(gè)XB3-like基因的表達(dá)受激素和非生物脅迫信號(hào)的影響，預(yù)示著它們可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)過程中扮演了重要角色。
　　 (5)擬南芥XBAT3

11、1表達(dá)受多種激素和非生物脅迫信號(hào)的誘導(dǎo)。于是我們對(duì)XBAT31基因的功能產(chǎn)生興趣。我們將基因上游2Kb啟動(dòng)子序列與GUS報(bào)告基因連接后表達(dá)，發(fā)現(xiàn)XBAT31在不同組織均有表達(dá)，其中莖、葉及花序中表達(dá)量較高。
　　 (6) XBAT31基因低量表達(dá)突變體在萌發(fā)期和苗生長(zhǎng)早期對(duì)鹽脅迫耐受性較野生型擬南芥低。其中，突變體內(nèi)非依賴ABA途徑內(nèi)的基因表達(dá)量明顯降低，可能是使突變體在萌發(fā)期和苗期對(duì)鹽脅迫的耐受性降低的原因。因此，我們推測(cè)XB