無選擇標記高含類黃酮抗晚疫病馬鈴薯轉基因研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界上第四大糧食作物，由疫霉菌（Phytophthora infestans de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產上的一種毀滅性病害。類黃酮是一類天然的植物次生代謝產物，具有抗氧化和抗病毒病等重要功能，而目前廣泛種植的馬鈴薯品種中僅含有痕量的類黃酮。本研究通過轉化馬鈴薯植物類黃酮調控基因AtMYB12、馬鈴薯野生種來源的抗晚疫病基因Rpi-vnt1.1、Rpi-mcq1.1和Rpi

2、-mcq1.2基因，獲得一系列不同組合富含黃酮醇（如蘆丁等）和抗晚疫病基因的馬鈴薯轉基因品系。有望從晚疫病抗性和營養(yǎng)價值上對現有品種進行改良。主要研究內容包括：
　　 ⑴利用Cre/lox特異位點重組系統(tǒng)載體pX6-GFP，采用高保真PCR技術，通過分步克隆的策略，分別構建了pX6-patatin::AtMYB12；pX6-Rpi-mcq1.1-Rpi-mcq1.2；pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1

3、-Rpi-vnt1.1等三個載體，并導入農桿菌工程菌AGL I中。采用莖段轉化法將上述3個載體轉化晚疫病感病栽培種Desiree，分別獲得PCR陽性轉基因植株28株、20株和20株，陽性轉化效率分別達到68％、40％和45％。
　　 ⑵利用6個不同來源的馬鈴薯晚疫病菌株，采用離體葉片接種的方法對攜帶抗病基因的轉基因系進行抗病性檢測。結果顯示轉pX6-Rpi-mcq1.1-Rpi-mcq1.2雙基因植株高抗EC1，90128兩個菌

4、株；轉pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1-Rpi-vnt1.1三基因植株抗所有檢測的六種菌株。研究結果與預期相符，所選基因完整被轉入到馬鈴薯品種Desiree中。
　　 ⑶利用HPLC法對兩個攜帶AtMYB12基因的部分轉基因株系進行了類黃酮含量檢測，轉基因pX6-patatin::AtMYB12馬鈴薯中蘆丁含量在0.051-3.091mg g-1之間，山奈酚-蕓香糖苷的含量達到0.041-0.951

5、mg g-1之間。轉pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1-Rpi-vnt1.1馬鈴薯中類黃酮蘆丁含量在0.08-0.2 mg g-1之間。總體類黃酮含量顯著提高。
　　 ⑷基于抗病表型或類黃酮含量分析，以及外觀株型性狀的穩(wěn)定性，每個轉基因組合各選擇了2個株系進行了β-雌二醇的誘導處理，經NPTII基因特異性引物分析，分別獲得無抗生素篩選標記的轉基因株系并重新進行了抗病性檢測。結果表明β-雌二醇的誘導產生