E-鈣粘蛋白核心巖藻糖基化對(duì)腫瘤細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白胞內(nèi)分布的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、E-鈣粘蛋白作為含有高甘露糖型N-糖鏈的細(xì)胞粘附分子，介導(dǎo)著細(xì)胞間的嗜同性粘附。而其下游分子β-連環(huán)蛋白，不僅參與E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附，還起著調(diào)節(jié)某些腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性的作用。近些年來，已有一些關(guān)于糖基化修飾影響E-鈣粘蛋白功能的報(bào)道。而由α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut8，corefucosyltransferase)催化的核心巖藻糖基化修飾，同樣對(duì)E-鈣粘蛋白的功能起到了一定的修飾作用。但核心巖藻糖基化修飾E一鈣粘蛋白，是否對(duì)

2、其下游分子β-連環(huán)蛋白的表達(dá)、分布有一定的影響，目前還沒有相關(guān)的報(bào)道。對(duì)于這部分內(nèi)容的深入探討，能夠進(jìn)一步闡明核心巖藻糖基化E一鈣粘蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的作用。 在本論文研究中，我們首先觀察了在表達(dá)不同水平核心巖藻糖基化E一鈣粘蛋白的細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的胞內(nèi)分布以及表達(dá)水平。我們采用的研究對(duì)象是人巨細(xì)胞性肺癌細(xì)胞株95C和95D，這對(duì)細(xì)胞來源于同一病人，但具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，在這對(duì)細(xì)胞中，核心巖藻糖基化

3、E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平，95C明顯低于95D，其中95C幾乎檢測不到此種糖基化修飾E-鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)的存在。采用Westernblot技術(shù)檢測β-連環(huán)蛋白在總蛋白、胞漿以及胞核蛋白中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在總蛋白水平上，95C的β-連環(huán)蛋白表達(dá)量低于95D，胞漿水平上兩細(xì)胞株之間并不存在很大的差異，而核內(nèi)的表達(dá)量上，95C反而稍高于95D。為了進(jìn)一步觀察核心巖藻糖基化E一鈣粘蛋白與β-連環(huán)蛋白的胞內(nèi)分布的相關(guān)性，我們采用在95C細(xì)胞株中過表達(dá)以

4、及在95D細(xì)胞株中干擾核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方法，檢測相應(yīng)的β-連環(huán)蛋白的胞內(nèi)分布。結(jié)果顯示，過表達(dá)核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的95C細(xì)胞中，出現(xiàn)了明顯的核心巖藻糖基化的E-鈣粘蛋白表達(dá)，核內(nèi)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平低于相應(yīng)的對(duì)照組，而干擾了核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的95D細(xì)胞中，核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白表達(dá)水平高于相應(yīng)的對(duì)照組，而在總蛋白以及胞漿蛋白水平上，β-連環(huán)蛋白的量沒有明顯變化。接下來，我們采用人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231,MDA-MB

5、-468以及MCF-7進(jìn)一步驗(yàn)證核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白與核內(nèi)β-連環(huán)蛋白表達(dá)量之間的相互關(guān)系。在E-鈣粘蛋白陰性的MDA-MB-231細(xì)胞株中，升高或降低其核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶水平并不改變核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。而在較高表達(dá)核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白的MDA-MB-468以及MCF-7細(xì)胞株中，通過RNA干擾降低核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶水平，進(jìn)而降低核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白水平，能夠顯著提高核內(nèi)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)量。 目前的研究

6、發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白能夠與Tcf/Lef形成異二聚體，并激活下游目的基因。因此我們利用熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)，以TOPflash／FOPflash來衡量β-連環(huán)蛋白／Tcf的轉(zhuǎn)錄活性，檢測β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。同時(shí)，通過Westernblot的方法檢測受β-連環(huán)蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄的下游靶基因：c-myc和cyclinD1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著核內(nèi)β-連環(huán)蛋白水平的變化，β-連環(huán)蛋白／Tcf的轉(zhuǎn)錄活性以及下游靶

7、基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。 為了探討核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白核內(nèi)表達(dá)水平變化的可能機(jī)制，我們檢測了β-連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化水平。通過免疫共沉淀以及Westernblot的方法，我們發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白的95C轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中，β-連環(huán)蛋白總體酪氨酸磷酸化以及654位點(diǎn)的酪氨酸磷酸化水平均呈現(xiàn)低水平，而在低表達(dá)核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白的95D轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中，酪氨酸磷酸化的水平均較高。以往

8、文獻(xiàn)已經(jīng)證明，酪氨酸磷酸化水平越高，其與E-鈣粘蛋白的結(jié)合力越弱，同時(shí)654位點(diǎn)的酪氨酸磷酸化水平增高，不僅能夠顯著降低β-連環(huán)蛋白與E-鈣粘蛋白的親和力，而且能夠增強(qiáng)β-連環(huán)蛋白與啟動(dòng)子區(qū)域TATA結(jié)合的能力，因此本實(shí)驗(yàn)中觀察到的β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化一定程度上能夠解釋?duì)?連環(huán)蛋白核內(nèi)表達(dá)水平的變化。 綜上所述，核心巖藻糖基化E-鈣粘蛋白能夠通過降低β-連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化以及654位點(diǎn)的酪氨酸磷酸化水平，使得β