新的UBA家族蛋白TM4在糖尿病血管病變中的作用研究.pdf

1、第一部分 TM4基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　 目的:從人主動脈組織中克隆TM4基因,運用生物信息學(xué)技術(shù)對TM4基因及蛋白進(jìn)行綜合分析,為下一步研究工作指明方向。
　　 方法:運用RT-PCR技術(shù)克隆TM4基因全長,將TM4基因克隆到pDrive載體中,經(jīng)酶切、測序證實TM4基因序列的正確性,進(jìn)一步運用生物信息學(xué)技術(shù)對TM4基因及蛋白的結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:1)TM4基因存在兩個剪切體,其ORF分

2、別為1035bp和915bp,主動脈組織中主要表達(dá)長剪切體。2)成功克隆出TM4基因的長剪切體并成功構(gòu)建序列正確的pDrive-TM4克隆載體。3)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):TM4基因(長剪切體)定位于13q32.3,編碼344個氨基酸,廣泛表達(dá)于多種組織;數(shù)據(jù)庫中尚未出現(xiàn)與TM4基因及蛋白序列完全一致的序列,但其序列與多種物種中的UBAC2(UBA domaincontaining 2)基因及蛋白序列高度同源;TM4蛋白為含有4個穿膜結(jié)構(gòu)袢

3、的膜蛋白,在胞內(nèi)段第89位絲氨酸殘基上含有PKC磷酸化位點,在C末端含有一個保守的功能結(jié)構(gòu)域－泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin Associated domain,UBA domain),UBA結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守;TM4可能是一個參與某種或某些物質(zhì)轉(zhuǎn)運的蛋白。
　　 結(jié)論:1)TM4是一個廣泛表達(dá)于多種組織、存在兩種剪切體的新基因。2)TM4是一個含有4個穿膜結(jié)構(gòu)袢的膜蛋白,UBA結(jié)構(gòu)域?qū)M4蛋白功能的發(fā)揮可能起重要

4、作用。3)TM4蛋白可能參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運。
　　 第二部分 TM4基因真核表達(dá)載體及腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:構(gòu)建TM4基因的真核表達(dá)載體和腺病毒表達(dá)載體,為下一步TM4蛋白功能等研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以pDrive-TM4質(zhì)粒為模板,通過PCR擴增出TM4基因的ORF,將TM4基因克隆到真核表達(dá)載體PDC315及PDC315-GFP中,并用酶切、測序證實TM4基因序列的正確性,進(jìn)一步用PDC31

5、5-GFP-TM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以證實質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。以PDC315-6FP-TM4及PDC315-TM4質(zhì)粒作為穿梭質(zhì)粒,與含5型腺病毒基因組的輔助質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre重組包裝腺病毒表達(dá)載體,并經(jīng)PCR及細(xì)胞感染證實病毒包裝是否成功。
　　 結(jié)果:1)成功構(gòu)建TM4真核表達(dá)載體PDC315-TM4及PDC315-GFP-TM4,經(jīng)酶切及測序鑒定序列正確,PDC315一GFP-TM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以正確表

6、達(dá)GFP蛋白。2)成功包裝表達(dá)TM4基因的重組腺病毒載體,經(jīng)PCR及細(xì)胞感染實驗證實病毒包裝成功。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建TM4真核表達(dá)載體及重組腺病毒載體。
　　 第三部分 應(yīng)用酵母雙雜交篩選TM4蛋白的相互作用蛋白
　　 目的:應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與TM4蛋白可能存在相互作用的蛋白。
　　 方法:以pDrive-TM4質(zhì)粒為模板,PCR擴增出TM4基因的ORF,構(gòu)建重組酵母質(zhì)粒pGB-TM4,驗證TM

7、4蛋白是否具有自激活報告基因的能力。pGB-TM4誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩庫宿主菌Y190,檢測誘餌基因是否激活報告基因,然后篩選酵母cDNA文庫,鑒定陽性克隆,抽提酵母質(zhì)粒,篩庫所得獵物(Prey)質(zhì)粒與誘餌(Bait)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化Y190菌,進(jìn)一步驗證其相互作用。測序得到陽性克隆序列,數(shù)據(jù)庫序列比對明確基因。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建pGB-TM4重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒沒有自激活報告基因的能力,在cDNA文庫轉(zhuǎn)化克隆中,得到5個陽性克隆,經(jīng)測

8、序及blastn比對證實均為NR4A1基因,將Prey質(zhì)粒與Bait質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化Y190菌,可以激活報告基因,提示NR4A1可能為TM4蛋白的相互作用蛋白。
　　 結(jié)論:應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選到TM4蛋白的可能相互作用蛋白-NR4A1,為進(jìn)一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四部分 應(yīng)用基因誘捕建立TM4基因突變小鼠模型
　　 目的:應(yīng)用基因誘捕(gene trap)技術(shù)建立TM4基因突變小鼠模型,為進(jìn)一步深入研

9、究TM4功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:應(yīng)用基因誘捕方法制備TM4基因突變小鼠模型。從基因誘捕ES細(xì)胞庫獲得含TM4基因突變的ES細(xì)胞株RRQ018,將ES細(xì)胞囊胚顯微注射到C57BL/6J小鼠的囊胚腔中,然后將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的輸卵管中。出生仔鼠中毛色嵌合率在50％以上的小鼠為嵌合體小鼠,將雄性嵌合體小鼠與C57BL/6J雌性小鼠交配,留下灰色仔鼠剪尾做基因型分析。獲得的雜合子小鼠為F1代,F1雜合子交配產(chǎn)下F2代小鼠,

10、用PCR方法鑒定小鼠體內(nèi)的TM4基因是否發(fā)生突變。
　　 結(jié)果:獲得9只雄性嵌合體小鼠,其中編號為5號和8號的兩只嵌合體雄鼠可以產(chǎn)下灰色仔鼠。F1代中獲得TM4基因突變雜合子小鼠,F1代雜合子交配獲得的F2代小鼠在DNA水平鑒定證實基因誘捕載體成功插入TM4基因的內(nèi)含子中,但是在RNA水平發(fā)現(xiàn)TM4基因僅發(fā)生部分突變,即產(chǎn)生TM4基因功能部分性缺失突變,未能產(chǎn)生TM4基因功能完全性缺失突變。
　　 結(jié)論:建立TM4基因功

11、能部分性缺失突變小鼠模型,未能建立TM4基因功能完全性缺失突變小鼠模型。
　　 第五部分 TM4蛋白在糖尿病血管損傷中的作用初步研究
　　 目的:研究TM4蛋白在組織和血管細(xì)胞中的分布、亞細(xì)胞定位;初步研究高糖、AGEs等因素對TM4蛋白表達(dá)的影響;初步研究TM4蛋白對細(xì)胞增殖的影響;初步研究TM4基因功能部分喪失對Nur77蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法:1)運用RT-PCR、免疫組化方法研究TM4基因的組織表達(dá)

12、譜以及在血管細(xì)胞中的表達(dá)譜。2)應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)觀察TM4蛋白的亞細(xì)胞定位。3)應(yīng)用Westen blot方法觀察高糖、AGEs等因素對TM4蛋白表達(dá)的影響。4)用XTT法研究TM4蛋白對細(xì)胞增殖的影響。5)用Westen blot技術(shù)觀察TM4基因功能部分喪失后對Nur77蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1)TM4基因廣泛表達(dá)于體內(nèi)多種組織,血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中均有TM4表達(dá),TM4蛋白可表達(dá)于血管內(nèi)膜、中膜

13、及外膜。2)TM4蛋白定位于核膜及細(xì)胞膜。3)高糖、AGEs、PKC激動劑TPA上調(diào)TM4基因的表達(dá),吡咯列酮下調(diào)TM4基因的表達(dá)。4)過表達(dá)TM4促進(jìn)細(xì)胞增殖。5)TM4基因功能部分喪失后Nur77蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:TM4基因廣泛表達(dá)于多種組織,血管內(nèi)皮、平滑肌及巨噬細(xì)胞均表達(dá)TM4基因,TM4的表達(dá)受高糖、AGEs等因素調(diào)控,TM4過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖,TM4基因功能部分喪失后Nur77蛋白表達(dá)上調(diào)。TM4蛋白在糖尿