RHDV衣殼蛋白P2亞區(qū)與兔主要靶細(xì)胞相互作用蛋白的篩選和初步鑒定.pdf

1、兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是嚴(yán)重危害兔產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性傳染病，其病原為兔出血癥病毒（RHDV）。RHDV衣殼蛋白VP60 P2亞區(qū)在病毒吸附入侵宿主細(xì)胞過程中起重要作用，以P2為誘餌蛋白研究RHDV的致病機(jī)理具有重要意義。兔肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、腎細(xì)胞是RHDV的主要靶細(xì)胞。本研究通過免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP)結(jié)合質(zhì)譜分析篩選兔主要靶細(xì)胞中與RHDV P2相互作用的蛋白，為深入研究RHDV的感染

2、過程、揭示RHDV的致病機(jī)理提供線索。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.RHDV衣殼蛋白P2誘餌蛋白的表達(dá)與鑒定
　　以皖阜株RHDV（FJ794180，RHDVa型）的結(jié)構(gòu)蛋白VP60基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物克隆P2亞區(qū)基因，雙酶切后連接到pET-32a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建pET-32a-P2重組載體。經(jīng)測(cè)序正確的重組載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎菌體，獲得高表達(dá)量的可溶性重組P2蛋白，western bl

3、otting鑒定其特異性。經(jīng)His TrapTMHP純化柱純化獲得了較純的P2蛋白。
　　2.RHDV衣殼蛋白P2亞區(qū)與兔主要靶細(xì)胞相互作用蛋白的篩選和初步鑒定
　　取2月齡以上的健康非免兔，分離得到原代兔肝、脾、腎細(xì)胞，以原核表達(dá)的P2蛋白為誘餌蛋白，通過免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-W)結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與P2相互作用的靶細(xì)胞蛋白，并對(duì)篩選到的蛋白進(jìn)行GO、KOG、KEGG生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，(1)兔肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、腎細(xì)胞中

4、分別篩選到67個(gè)、169個(gè)、100個(gè)與P2存在潛在相互作用的蛋白，其中肝細(xì)胞和脾細(xì)胞中同時(shí)鑒定到的蛋白有6個(gè)，肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中同時(shí)鑒定到的蛋白有11個(gè)，脾細(xì)胞和腎細(xì)胞中同時(shí)鑒定到的蛋白有17個(gè)。值得注意的是，在兔肝細(xì)胞和脾細(xì)胞中均篩選到LamR蛋白，該蛋白是多種病毒的受體，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。(2)GO注釋發(fā)現(xiàn)三種靶細(xì)胞中與P2有潛在相互作用蛋白的分布規(guī)律大體一致。這些蛋白大多定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和細(xì)胞膜;參與細(xì)胞過程、代謝過程和單一

5、有機(jī)體過程;具有催化活性和結(jié)合活性。KOG分類顯示，這些蛋白多歸類到脂類運(yùn)輸及代謝、一般功能蛋白、翻譯后修飾和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及分子伴侶、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)參與代謝通路的互作蛋白遠(yuǎn)高于參與其他通路的互作蛋白。
　　3.LamR與RHDV及其蛋白相互作用的初步鑒定
　　在兔肝細(xì)胞和脾細(xì)胞中篩選到與P2潛在的互作蛋白——層黏連蛋白受體（LamR）蛋白，該蛋白具有廣泛的生理和病理功能，是多種病毒的受體，為

6、進(jìn)一步確認(rèn)LamR與P2蛋白的相互作用，我們進(jìn)行了以下試驗(yàn):(1)通過激光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了肝細(xì)胞和脾細(xì)胞上LamR與P2蛋白的共定位。(2)原核表達(dá)了LamR蛋白。通過GSTpull-down試驗(yàn)驗(yàn)證了LamR蛋白與P2蛋白的直接結(jié)合。免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了純化的GST-LamR蛋白能夠阻斷P2與原代肝細(xì)胞的結(jié)合，且該阻斷效果與LamR/P2蛋白濃度比有關(guān)。(3)將實(shí)驗(yàn)回歸到天然RHDV病毒粒子上。體外實(shí)驗(yàn)，通過激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明了RHDV