過氧化物酶體增殖物激活受體γ及其配體在防治腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化中作用及機制的實驗研究.pdf

1、前言：
　　 腹膜透析(peritoneal dialysis，P D)是終末期腎臟病的主要替代療法，具有血液透析(hemodialysis，HD)無法替代的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的用于PD的腹膜透析液具有非生理性的高濃度葡萄糖、高滲、低PH值等特點。腹膜間皮細胞(peritoneal mesothelialcells，PMC)是腹膜表面的一層細胞，是腹膜透析時與腹膜透析液直接接觸的第一道生理屏障，高濃度葡萄糖糖可調(diào)節(jié)PD期間PMC的代謝，

2、抑制PMC的生長和再生，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)基因表達，促進氧化損傷和增加終末糖基化產(chǎn)物，這些因素均促進腹膜纖維化。高糖對腹膜間皮細胞的損傷是PD相關(guān)腹膜纖維化的始動因素，也是研究PD相關(guān)腹膜纖維化的主要切入點。目前高濃度葡萄糖損傷腹膜間皮細胞的機制尚未完全闡明。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activato

3、rγ，PPARγ)是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。通過與其DNA上的應(yīng)答元件結(jié)合以及與活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子kappaB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)等相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)相應(yīng)的目標基因表達，PPARγ最先被定義為調(diào)節(jié)脂肪細胞特定基因表達和誘導(dǎo)前脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子。目前認為，PPARγ在保護心血管損傷、抑制炎癥反應(yīng)、控制腫瘤生長、抗纖

4、維化中起關(guān)鍵作用。PPARγ活化后可調(diào)控多種細胞因子的生成，如結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth fator，CTGF）、纖溶酶原激活抑制因子-1(plasminogenactivator inhibitor1，PAI-1)、腫瘤壞死因子、單核細胞趨化蛋白-1等?；罨腜PARγ可減少上述細胞因子的生成，產(chǎn)生抗炎癥及抗纖維化效應(yīng)。
　　 CTGF和PAI-1是重要的促纖維化因子，在多種纖維化病變中

5、表達上調(diào)。CTGF作為TGF-β的重要下游因子，介導(dǎo)TGF-β的促纖維化作用，高糖可促進PMC分泌CTGF，CTGF作用于PMC本身及間質(zhì)成纖維細胞，誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)分化，增加細胞外基質(zhì)的合成和積聚，促進腹膜纖維化。PAI-1是纖溶酶原激活物的主要抑制劑，能抑制纖溶酶，從而抑制金屬蛋白酶，減少細胞外基質(zhì)的降解。PD時，高濃度葡萄糖促進PMC PAI-1的表達，抑制細胞外基質(zhì)的降解，在PD相關(guān)腹膜纖維化發(fā)生中起重要作用。
　　 PMC結(jié)

6、構(gòu)性表達PPARγ，PPARγ在PMC的功能尚不清楚。本研究用腹透液相關(guān)濃度葡萄糖處理PMC，觀察PPARγ表達的變化，以及PPARγ配體吡格列酮(pioglitazone，Pio)和15-脫氧前列腺素J2(15-deoxy-deta12，14-prostaglandinJ2，15 d-PGJ2)對高糖條件下PMC CTGF、PAI-1表達及對AP-1、NF-κB途徑活性的影響，探討PPARγ及其配體在PD相關(guān)腹膜纖維化中的作用及機制，

7、為PD相關(guān)腹膜纖維化的防治提供新的思路。
　　 方法：
　　 1、組織來源:雄性Wistar大鼠數(shù)只，體重140±20g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供。
　　 2、細胞培養(yǎng):胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)PMC，倒置相差顯微鏡、免疫細胞化學(xué)方法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　 3、在高糖作用下，用RT-PCR法檢測PMC PPARγmRNA的表達情況;用Westernblot法檢測PMC PPARγ蛋白

8、的表達情況。
　　 細胞分組:
　　 (1)不同濃度葡萄糖組:1.5、2.5、4.25％;
　　 (2)2.5％葡萄糖作用不同時間組:0、6、12、24、36、48、72h;
　　 (3)不同濃度甘露醇組:1.5、2.5、4.25％。
　　 4、在吡格列酮和15-脫氧前列腺素J2的作用下，用RT-PCR法檢測CTGF、PAI-1、c-fos、c-jun mRNA的表達情況;用Western blo

9、t法檢測PMC CTGF、PAI-1、I-κBα、NF-κBp65蛋白表達的情況。
　　 細胞分組:
　　 (1)不同濃度(5、15μM)吡格列酮預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h;
　　 (2)不同濃度(5、15μM)15d-PGJ2預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h。
　　 5、在NF-κB抑制劑二硫氨基甲酸吡咯烷(Ammonium pyrrolidinedithiocarbomate

10、，PDTC)和AP-1抑制劑姜黃素(curcumin，Cur)作用下，Western blot法檢測PMC CTGF、PAI-1蛋白表達的情況。
　　 細胞分組:
　　 (1)不同濃度(25、50μM) PDTC預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h;
　　 (2)不同濃度(15、30μM)姜黃素預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h。
　　 結(jié)果:
　　 1、葡萄糖抑制PMC表達PPAR

11、γ
　　 1.5％的葡萄糖可抑制PPARγmRNA和蛋白的表達，4.25％葡萄糖的作用最強，2.5％的葡萄糖作用6h時PPARγmRNA和蛋白表達減少，72h時PPARγmRNA和蛋白表達最少，與葡萄糖相同濃度的甘露醇對PMC PPARγmRNA和蛋白表達無影響。
　　 2、吡格列酮和15d-PGJ2對高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1達的影響
　　 2.5％葡萄糖增加PMC CTGF、PAI-1的表達，吡格列

12、酮和15-脫氧前列腺素J2均可減少高糖條件下PMC CTGF、PAI-1的表達。
　　 3、PDTC和姜黃素對高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1表達的影響
　　 PDTC和姜黃素預(yù)處理PMC后，抑制了高糖誘導(dǎo)的CTGF、PAI-1蛋白的表達。
　　 4、吡格列酮和15d-PGJ2對高糖條件下PMC NF-κB和AP-1信號途徑的影響
　　 2.5％葡萄糖減少胞漿中I-κBα蛋白表達，增加胞核中NF-κB

13、p65蛋白的表達，吡格列酮和15d-PGJ2增加高糖條件下I-κBα蛋白的表達，減少胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達，抑制NF-κB進入胞核從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性;2.5％葡萄糖增加AP-1亞單位c-fos、c-jun mRNA的表達，吡格列酮和15-脫氧前列腺素J2抑制高糖條件下c-fos、c-jun mRNA的表達。
　　 結(jié)論:
　　 1、葡萄糖抑制PMC PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達呈濃度和時間依賴性;
　

14、　 2、高濃度葡萄糖抑制PMC PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達與其產(chǎn)生的高滲透壓無關(guān);
　　 3、PPAR配體吡格列酮和15d-PGJ2抑制高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1的表達，激活PPARγ可能在防治PD相關(guān)腹膜纖維化中發(fā)揮作用;
　　 4、高糖可能通過NF-κB和AP-1途徑促進PMC表達CTGF、PAI-1;
　　 5、激活PPARγ可能通過與NF-κB和AP-1途徑相互作用抑制高糖條件下PMC表