豬溶素與巖藻糖在紅細(xì)胞膜上的相互作用及仔豬免疫試驗.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一種重要的人畜共患病原性細(xì)菌，人感染豬鏈球菌后引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心肌炎，甚至導(dǎo)致休克死亡。1998年和2005年在我國發(fā)生的兩次豬鏈球菌疫情中鏈球菌中毒性休克綜合征的發(fā)病率明顯高于世界其它國家。目前，豬溶素(Suilysin,SLY)是豬鏈球菌唯一已知的分泌性蛋白質(zhì)毒素，與人發(fā)生鏈球菌中毒性休克綜合征有關(guān)，它能裂解紅細(xì)胞、刺激巨噬細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子，也能引起實驗動物

2、產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。豬溶素也是一種保護(hù)性抗原，基因修飾的無毒突變子能刺激小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。豬溶素屬于膽固醇依賴性細(xì)胞裂解毒素(Cholesterol dependent cytolysins,CDCs)，具有CDCs分子的典型晶體結(jié)構(gòu)。
　　CDCs分子以產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O為原型毒素。長期以來，學(xué)界認(rèn)為CDCs分子結(jié)合到細(xì)胞膜表面的膽固醇后自動寡聚化形成環(huán)狀復(fù)合物，繼而以打孔的方式裂解細(xì)胞。但近年來對Intermedilys

3、in（ILY)、Vaginolysin（VLY）及Pneumolysin（PLY)與細(xì)胞的相互作用研究打破了膽固醇是CDCs唯一受體的論斷。研究發(fā)現(xiàn)ILY、VLY特異性結(jié)合人CD59分子，PLY與Lewis X有較高的親和力，Kd值為1.88×10-5M。
　　由于SLYP353L突變子不能裂解紅細(xì)胞而是凝集紅細(xì)胞，而且膽固醇不能完全阻斷SLYP353L與紅細(xì)胞膜的結(jié)合，說明SLY可能與ILY、VLY等CDCs分子相似，與紅細(xì)胞間

4、存在多個結(jié)合位點。本研究分析了單糖與SLY的相互作用，并對仔豬進(jìn)行rSLYP353L亞單位疫苗免疫，結(jié)果如下：
　　1. rSLY、rSLYP353L在紅細(xì)胞膜上有不同的存在形式
　　將rSLY，rSLYP353L與紅細(xì)胞懸液孵育后，收集經(jīng)rSLY裂解的紅細(xì)胞膜碎片、rSLYP353L凝集的紅細(xì)胞用低滲緩沖液處理后收集膜碎片。將rSLY-膜復(fù)合物、rSLYP353L-膜復(fù)合物經(jīng)SDS—AGE凝膠電泳后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測（

5、一抗為兔抗rSLYP353L IgG)，結(jié)果顯示，rSLY在紅細(xì)胞膜上以單體、二聚體及寡聚體形式存在，而rSLYP353L在紅細(xì)胞膜上僅存在單體形式。
　　2.單糖對rSLY、rSLYP353L活性的影響
　　分析上述實驗結(jié)果并查閱其它文獻(xiàn)資料，初步推測SLY可能結(jié)合紅細(xì)胞表面除膽固醇外的其它受體分子，特別是糖基化受體。用巖藻糖、甘露糖、葡萄糖進(jìn)行阻斷試驗，結(jié)果表明，278mmol/L的三種糖溶液能夠阻斷2HAU rSLYP

6、353L的凝血活性和2HU rSLY的溶血活性；當(dāng)糖濃度低于139mmol/L時，只有巖藻糖溶液有阻斷作用；當(dāng)糖濃度低于70mmol/L時三種糖溶液均無阻斷作用。278mmol/L的三種糖溶液均不能阻斷16HAU rSLYP353L的凝血活性和16HU rSLY的溶血活性。因此，巖藻糖溶液的阻斷作用最強(qiáng)。用巖藻糖苷酶水解紅細(xì)胞膜表面的巖藻糖殘基后，rSLYP353L的凝血活性降低2倍，rSLY的溶血活性也有所降低。
　　3.巖藻糖

7、對rSLY、rSLYP353L與紅細(xì)胞膜結(jié)合作用的影響
　　將rSLY、rSLYP353L分別與膽固醇溶液、巖藻糖溶液、膽固醇和巖藻糖混合溶液孵育30min后，加入2％的紅細(xì)胞懸液，再孵育1h。收集紅細(xì)胞并洗滌，經(jīng)低滲緩沖液裂解后，收集rSLY-膜復(fù)合物、rSLYP353L-膜復(fù)合，經(jīng)SDS—PAGE電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：膽固醇能完全阻斷rSLYP353L凝血活性，少量rSLYP353L依然可以結(jié)合到紅細(xì)胞膜上，但結(jié)

8、合量少于巖藻糖阻斷組；膽固醇與巖藻糖阻斷組中紅細(xì)胞膜上未檢測到rSLYP353L。對于rSLY有相似的結(jié)果，但巖藻糖難以完全阻斷其溶血活性。
　　4.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳測定rSLY、rSLYP353L與單糖的親和力
　　制備含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖的非變性聚丙烯酰胺凝膠（凝膠濃度12%，單糖濃度110mmol/L），rSLY、rSLYP353L樣品在冰水混合物浴下電泳，以不含糖的非變性膠為對照。測定rSLY、rSLYP

9、353L在非變性凝膠中的遷移距離，計算遷移率。結(jié)果表明rSLY、rSLYP353L在含有巖藻糖的凝膠中遷移率分別降低1.7%和2.7%；rSLY在含有甘露糖和葡萄糖的凝膠中遷移率均降低了1%，rSLYP353L均未降低。
　　5.預(yù)測rSLYP353L與巖藻糖相互作用的位點
　　通過NCBI和ZINC獲取rSLYP353L與巖藻糖的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，利用CLC Drug Discovery Workbench2計算可知rSLYP

10、353L存在9個可能的Binding pockets，與L-fucose晶體結(jié)構(gòu)比對后所最高得分值為93.2%。巖藻糖最佳結(jié)合位點可能是在rSLYP353L的第一結(jié)構(gòu)域，通過與Tyr98，Pro99和Val150形成氫鍵結(jié)合到rSLYP353L分子上。
　　6.仔豬免疫的免疫試驗
　　以氫氧化鋁凝膠為佐劑制備rSLYP353L亞單位疫苗，分三組進(jìn)行免疫接種試驗:每次接種含50μg rSLYP353L的疫苗，接種兩次；每次接種