濕地松、火炬松離體培養(yǎng)植株再生技術(shù)的研究.pdf

1、濕地松、火炬松自上世紀(jì)30年代引種至今，兩樹種已成為我國南方地區(qū)大面積造林的主要經(jīng)濟(jì)樹種。然而，其相對(duì)滯后的良種繁育技術(shù)仍然制約著兩個(gè)樹種的發(fā)展。本研究以濕地松、火炬松不同組織器官為材料，對(duì)其直接器官發(fā)生、間接器官發(fā)生、直接體胚發(fā)生等離體培養(yǎng)快繁技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以建立高效、穩(wěn)定的濕地松、火炬松離體培養(yǎng)植株再生體系，為其它針葉樹種的組培快繁技術(shù)提供借鑒。研究的主要內(nèi)容及結(jié)果以下： 一．濕地松直接器官發(fā)生與植株再生技術(shù) 以

2、濕地松抗病家系和非抗病家系的成熟合子胚為外植體，以不同基本培養(yǎng)基、激素種類及濃度配比和不同的培養(yǎng)方式，研究濕地松離體培養(yǎng)繼代增殖的關(guān)鍵技術(shù)及主要影響因子。研究結(jié)果表明濕地松家系或基因型、繼代代數(shù)及激素種類濃度的配比是濕地松組培繼代增殖效率的主要影響因子。濕地松組培快繁的最佳增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA2.0mg／L+IBA0.1mg/L，年增殖率可達(dá)3.696.2。利用家系間或家系內(nèi)個(gè)體間增殖率的顯著差異，篩選了適宜組培快繁的普通家系優(yōu)良

3、基因型132個(gè)、抗病家系優(yōu)良基因型2個(gè)。通過固體培養(yǎng)與添加液體營(yíng)養(yǎng)液的雙層培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式解決了濕地松繼代增殖率與有效芽苗率的消長(zhǎng)問題，有效縮短了繼代周期，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序。 生根培養(yǎng)階段，通過對(duì)培養(yǎng)基大量元素濃度水平的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明生根培養(yǎng)初期以無大量元素培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，25d后添加大量元素的培養(yǎng)程序可有效縮短生根培養(yǎng)時(shí)間，提高生根率，達(dá)到理想的生根效果。 本研究基本解決了濕地松長(zhǎng)期繼代增殖及生根技術(shù)問題，建立了穩(wěn)定

4、的離體快繁增殖及生根體系。但該培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需進(jìn)一步的中試及相關(guān)操作工藝設(shè)備的改進(jìn)，以降低組培苗的生產(chǎn)成本。 二、濕地松間接器官發(fā)生與植株再生技術(shù) 以濕地松成熟合子胚、胚苗頂芽、下胚軸、胚根為外植體，選用低鹽量的DCR、LP、TX 3種基本培養(yǎng)基，與不同濃度N從、2，4-D及不同濃度6-BA組合，研究濕地松器官性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及器官分化培養(yǎng)階段的關(guān)鍵技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明：成熟合子胚、胚苗頂芽是誘導(dǎo)器官性愈傷組織

5、理想的外植體，誘導(dǎo)器官性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為TX+BA 0.5 mg／L+NAA 2.0 mg/L+30 g／L蔗糖，誘導(dǎo)率高達(dá)50％以上；增殖培養(yǎng)基為Tx+BA 0.3 mg／L+NAA 1.0 mg／L+CH 400mg／L+30 g／L蔗糖，繼代周期25～30d，增殖率達(dá)3.46；器官分化培養(yǎng)基為TX+BA0.5 mg／L+IBA 0.5 mg／L+30 g／L蔗糖，每塊愈傷組織可分化20個(gè)以上不定芽；不定芽的同步化發(fā)育培養(yǎng)基為

6、TX+BA 0～0.2 mg／L+IBA 0.5 mg/L+30 g／L蔗糖；NAA是器官性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖必不可少的生長(zhǎng)素。濕地松間接器官發(fā)生程序復(fù)雜，但其增殖效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接器官發(fā)生效率。組織細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明：亮白色、半緊實(shí)結(jié)構(gòu)的外部形態(tài)及大量“擬分生組織”的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形成是器官性愈傷組織的重要標(biāo)志。不定芽原基的分化發(fā)育過程約為40～45d。 三、濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生 以濕地松成熟合子胚及未成熟合子胚為外植體，對(duì)

7、影響濕地松體胚誘導(dǎo)、ESM維持與增殖培養(yǎng)及體胚成熟等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的主要因素進(jìn)行系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明：多胚特征的合子胚發(fā)育階段是濕地松體胚誘導(dǎo)最理想的外植體，即發(fā)育第2、3、4階段的合子胚?；九囵B(yǎng)基、激素種類濃度組合及兩因素的交互作用對(duì)ESM誘導(dǎo)率及外植體褐化率均有極顯著影響，濕地松體胚發(fā)生最佳培養(yǎng)基激素組合為L(zhǎng)P+2，4-D 2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L和DCR+NAA2.0 mg／L+6-BA0.63mg／L+KT0

8、.61mg／L，4個(gè)家系在兩種培養(yǎng)基ESM平均誘導(dǎo)率分別為24％和22.75％。球果短時(shí)間冷藏處理、雌配子體“傾斜接種"方式以及在培養(yǎng)基添加乙烯抑制劑及pH緩沖液均有利于提高濕地松體胚誘導(dǎo)率，采用國產(chǎn)瓊脂代替進(jìn)口Phytagel作為植物凝膠劑可起到同樣的誘導(dǎo)效果。 ESM維持培養(yǎng)階段，胚性組織胚性的失去或因生長(zhǎng)勢(shì)的衰弱而死亡是針葉樹種體胚發(fā)生的普遍現(xiàn)象。通過對(duì)培養(yǎng)基與激素組合的優(yōu)化獲得了4個(gè)可長(zhǎng)期快速增殖的胚性細(xì)胞系，DCR+N

9、AA 1.0 mg／L+6-BA 0.32 mg／L+KT 0.30 mg／L為濕地松ESM的最佳增殖培養(yǎng)基。生長(zhǎng)素是維持胚性的極性結(jié)構(gòu)所必需的，但高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)體胚的生長(zhǎng)、發(fā)育成熟不利，尤其是高濃度2，4-D可能導(dǎo)致體胚的畸形。 添加AC的無激素預(yù)培養(yǎng)是體胚發(fā)育成熟的必要條件。ABA是體胚從增殖到成熟轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。外源ABA與PEG和高濃度蔗糖的組合進(jìn)一步促進(jìn)了體胚的發(fā)育成熟，濕地松體胚在成熟培養(yǎng)基PL+ABA 50 mg

10、／L+PEG6000 20％+6％蔗糖上獲得了發(fā)育5階段的子葉胚。 四、火炬松體細(xì)胞胚胎發(fā)生 以火炬松優(yōu)良家系20—692、20—615、20—1036、20—639不同球果采收期合子胚為外植體，選用4種針葉樹體胚發(fā)生專利培養(yǎng)基AL、TX、LP、DS分別與AL、TX、LP培養(yǎng)基激素組合及無激素組合形成16種體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，開展火炬松體胚誘導(dǎo)試驗(yàn)。研究結(jié)果表明：體胚誘導(dǎo)最理想的外植體為第2、3、4發(fā)育階段合子胚。外植體基因

11、型是影響體胚誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素，通過培養(yǎng)基、激素組合及其它培養(yǎng)條件的優(yōu)化是打破離體培養(yǎng)頑拗型基因型限制的有效措施。LP+2，4一D2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L、AL+2，4-D 2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L培養(yǎng)基可獲得較高的體胚誘導(dǎo)率，且體胚質(zhì)量高。 不同的胚性細(xì)胞系對(duì)體胚成熟培養(yǎng)反應(yīng)不同，只有具有完整體胚的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)基，體胚才能進(jìn)一步的發(fā)育成熟?；鹁嫠膳咝约?xì)胞系A(chǔ)L-225經(jīng)無激素培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)