家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的基因篩查研究.pdf

1、目的：家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）是一種以周邊視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常為特征的遺傳性眼底病，由Criswick和Schepens于1969年首次報道，是導(dǎo)致青少年視網(wǎng)膜脫離的主要原因之一。該病臨床表型具有復(fù)雜多樣性，遺傳異質(zhì)性明顯，目前6種致病基因被證實與FEVR發(fā)生有關(guān)，包括常染色體顯性或隱性遺傳基因 LRP5、FZD4和 TSPAN12，常染色體顯性遺傳基因 ZNF408和 KIF11基因，X染色體隱性遺傳基因NDP。本課題通

2、過對31個中國FEVR家系的遺傳學(xué)研究，探索中國地區(qū)FEVR患者的致病基因突變頻譜以及基因型表型之間的關(guān)聯(lián)，為患者提供遺傳咨詢，協(xié)助產(chǎn)前診斷，并為未來的基因治療奠定必要基礎(chǔ)。
　　方法：我們采集了31個FEVR先證者及其家系成員的外周靜脈血，并對他們做了詳細(xì)的病史采集以及全面的眼科檢查，并依據(jù)Pendergast制定的FEVR分期標(biāo)準(zhǔn)對31位先證者的病變程度進行分期。利用Sanger測序綜合性篩查已知6種致病基因的全部外顯子及其與

3、內(nèi)含子交界處50個堿基序列，隨后使用FinchTV軟件和MutationSurveyor軟件對樣本DNA序列與人類正?；蛐蛄羞M行對比分析，判斷是否存在變異，確定是何種類型的變異。對于候選基因變異先在千人基因組數(shù)據(jù)庫1000 Genomes(1000G)、迄今為止人類最大的外顯子組整合數(shù)據(jù)庫Exome Aggregation Consortium（ExAC）、NCBI的SNP(single nucleotide polymorphism

4、)數(shù)據(jù)庫（dbSNP）以及200個健康人群中進行排查，以確定是否為SNP。如果不是SNP，再通過美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）和美國分子病理學(xué)會（AMP）對變異解讀的標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)則以及多種生物信息學(xué)工具（SIFT、Mutation Taster、Polyphen2 HDIV、Polyphen2 HVAR、Mutation Assessor、PhD-SNP、SNPs＆GO、PROVEAN、LR、RadialSVM）去評估這些候選突變

5、位點的致病性，對于錯義突變利用ClustalW2和WebLogo3評估候選突變位點的氨基酸保守性，最后通過家系內(nèi)共分離驗證確定致病基因。
　　結(jié)果：本研究31位先證者，均為足月順產(chǎn)新生兒，無低出生體重史。大部分患者在年幼時即因斜視、眼球震顫或者白瞳癥等被父母發(fā)現(xiàn)前來就診，臨床檢查結(jié)果顯示疾病特征性眼底改變?nèi)缫暰W(wǎng)膜鐮狀皺襞、視網(wǎng)膜內(nèi)視網(wǎng)膜下滲出，甚至病情嚴(yán)重者在嬰幼兒期就發(fā)生牽拉性或滲出性網(wǎng)脫。12個先證者在全部的已知致病基因中檢測

6、到突變，包括2個無義突變，5個移碼突變和5個錯義突變，除了移碼突變(FZD4，c.1282_1285delGACA, p.D428fs)在以往的研究中曾報道，其他11個均為新發(fā)現(xiàn)的突變，具體為：分別在家系F9和家系F15的先證者發(fā)現(xiàn)了無義突變(LRP5, c.1384C＞T, p.R462*;TSPAN12, c.345T＞G, p.Y115*)，共分離提示這兩個突變均來源于其父親，符合常染色體顯性遺傳特征；5個移碼突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前

7、終止，分別位于家系F11(LRP5, c.2817_2827+1del12bp, p.N940fs), F21(NDP, c.52_53ins32bp, p.S29fs), F20(FZD4,c.1282_1285delGACA, p.D428fs), F23(FZD4, c.227delA, p.E76fs)和F28(KIF11, c.1830_1833delACAA, p.E610fs);5種錯義突變中，3種發(fā)生于LRP5基因上(c

8、.4205G＞A, p.G1402D;c.2237G＞C, p.R746P;c.2618A＞T, p.K873M)，2種發(fā)生于NDP基因上(c.195C＞G, p.C65W; c.127C＞A, p.H43N)。所有的錯義突變均被ACMG和AMP共同提出的標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)則以及一系列生物信息學(xué)工具評估提示具有很強的致病性，且ClustalW2和WebLogo3分析結(jié)果提示從進化上低等的斑馬魚到高等的人類，5個錯義突變位點均位于高度保守的位置，表

9、明這些位點對蛋白正常功能起著重要的作用。
　　在這12個突變中，LRP5突變占有最大的比例42％，接著是NDP25%, FZD417%, TSPAN128%, KIF118%。基因型與臨床表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示所有由于NDP基因突變致病的患兒不論突變的來源，眼底改變均處于FEVR5期，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜完全脫離，且合并有一系列晚期眼底并發(fā)癥。此外，所有存在出生后短期吸氧的患者不論是何種致病基因，眼底均一致表現(xiàn)為視網(wǎng)膜完全脫離。