幽門螺桿菌對小鼠淋巴細(xì)胞及胃黏膜Tim-3的影響及其與Th免疫反應(yīng)的關(guān)系.pdf

1、目的：機(jī)體的免疫反應(yīng)在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)致病中起重要作用，闡明H.pylori感染的免疫致病機(jī)制對于H.pylori相關(guān)性疾病的防治具有十分重要的意義。輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)免疫反應(yīng)在H.pylori感染的免疫致病中起重要作用。但是H.pylori感染究竟通過何種機(jī)制影響Th反應(yīng)，目前尚不清楚。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子(T-cell immunoglobul

2、in andmucin-domain-containing molecule，Tim)是新近發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞表面的跨膜蛋白家族，它在CD4+T細(xì)胞分化成Th1和Th2細(xì)胞，及調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)中起重要作用。Tim-3是Tim家族中的重要成員，它表達(dá)在分化成熟的Th1細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)不同Th細(xì)胞亞群的功能，并影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)和Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號

3、通路。H.pylori感染對Tim-3的影響目前尚不清楚。為此本研究在體內(nèi)外觀察了H.pylori感染后Tim-3的表達(dá)，及其與Th1和Th2免疫反應(yīng)的關(guān)系，旨在初步探討H.pylori感染影響Th反應(yīng)的機(jī)制，為后續(xù)以Tim-3為靶點(diǎn)防治H.pylori感染和H.pylori相關(guān)性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴H.pylori活菌與小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)：以不同濃度的悉尼1號(SydneyStrain1，SS1)H.py

4、lori活菌與原代分離的BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12h，細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)之比分別為0 CFU：1(對照組)、100 CFU：1(實(shí)驗(yàn)組A)、400 CFU：1(實(shí)驗(yàn)組B)和700 CFU：1(實(shí)驗(yàn)組C)。⑵小鼠H.pylori感染模型建立：10只6-8周齡的清潔級的BALB/c小鼠，給予含1.0×109/ml的SS1 H.pylori活菌液，0.5ml/只，灌胃，隔日一次，共5次。末次灌胃后12周后處死小鼠，取胃黏膜進(jìn)行H.pylo

5、ri和病理學(xué)檢測，確定模型建立后，取標(biāo)本待測。另取10只小鼠不給予H.pylori，作為正常對照組。⑶各項(xiàng)指標(biāo)檢測：①胃黏膜內(nèi)H.pylori的檢測：采用改良Giemsa染色和H.pylori培養(yǎng)；②H.pylori作用小鼠淋巴細(xì)胞上清和胃黏膜內(nèi)IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量的檢測：采用雙抗體夾心ELISA法；③胃粘膜及淋巴細(xì)胞內(nèi)Tim-3、Foxp3、MyD88蛋白的檢測：采用Western blot。

6、r>　　 結(jié)果：①H.pylori活菌作用小鼠淋巴細(xì)胞12h后顯著上調(diào)小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)Tim-3、MyD88蛋白表達(dá)(P<0.005)，各實(shí)驗(yàn)組Tim-3蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.005)。實(shí)驗(yàn)組B和C MyD88蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組A MyD88蛋白表達(dá)與對照組無顯著差異(P>0.05)。Foxp3蛋白表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組和對照組無顯著差異(P>0.05)。②H.pylori活菌作用小鼠淋巴細(xì)胞12h后對IL

7、-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量均有顯著影響(P<0.001，0.05)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中IL-4和IL-10含量均顯著低于對照組，并隨著H.pylori活菌數(shù)增加，IL-4和IL-10含量逐漸降低(P<0.001，0.005，0.05)；各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中IL-12和IFN-γ含量均顯著高于對照組(P<0.005，0.05)，且實(shí)驗(yàn)組B和C顯著高于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.001)；各實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)上清中IL-2含量無顯著差

8、異(P>0.05)。③H.pylori感染小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3、MyD88和Foxp3蛋白表達(dá)均顯著高于正常對照組(P<0.01，0.05)。④胃黏膜內(nèi)IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量在對照組和H.pylori感染組之間均有顯著差異(P<0.01，0.05)，Th1細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ含量在H.pylori感染組均顯著高于正常對照組(P<0.005，0.05)，Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10含量在H.py

9、lori感染組均顯著低于正常對照組(P<0.01，0.05)。⑤在H.pylori感染組，小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3蛋白的表達(dá)與胃黏膜內(nèi)Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10含量呈顯著負(fù)相關(guān)(Rs=-0.922和-0.954，P<0.05)，與Th1細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12含量呈顯著正相關(guān)(Rs=0.902和0.933，P<0.05)；在正常對照組Tim-3蛋白的表達(dá)與胃黏膜內(nèi)IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12含量無顯著相關(guān)性(

10、R=-0.727，-0.531，0.746和0.630，P>0.05)。⑥在H.pylori感染組，小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3蛋白表達(dá)與MyD88蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(Rs=0.905，P<0.05)，與Foxp3蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)(Rs=0.723，P>0.05)；在正常對照組Tim-3蛋白表達(dá)與MyD88和Foxp3蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性(Rs=0.819和0.508，P>0.05)。
　　 結(jié)論：⑴H.pylori在體內(nèi)外均可上

11、調(diào)Tim-3的表達(dá)，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子，抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10細(xì)胞因子，提示它可抑制T淋巴細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Th1優(yōu)勢的免疫反應(yīng)。⑵H.pylori感染小鼠胃黏膜內(nèi)Tim-3表達(dá)與Th1細(xì)胞因子含量呈正相關(guān)，與Th2細(xì)胞因子含量呈負(fù)相關(guān)，說明H.pylori感染時Tim-3表達(dá)能較好的反映Th免疫反應(yīng)；同時也與胃黏膜內(nèi)TLRs信號通路中的關(guān)鍵分子My