全血STAT1(Y701)磷酸化水平快速檢測(cè)評(píng)估地塞米松對(duì)人體免疫的影響.pdf

1、目的: 由于JAK1-STAT1（Y701）信號(hào)傳導(dǎo)途徑在Th1細(xì)胞的分化與增殖過(guò)程中至關(guān)重要，所以其磷酸化水平可以被反映為Th1細(xì)胞功能。Th1細(xì)胞是一類專門分泌Th1類細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞亞群，在細(xì)胞免疫和移植物排斥反應(yīng)中起到極其重要的作用。JAK/STAT是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的信號(hào)蛋白家族，其蛋白質(zhì)磷酸化分子識(shí)別模式是受體蛋白直接與配體蛋白相藕連，快速介導(dǎo)蛋白質(zhì)磷酸化，介導(dǎo)宿主防御反應(yīng)、生長(zhǎng)調(diào)控、凋亡等重要生理病理現(xiàn)象。在臨床治療

2、過(guò)程中，常常使用大劑量的免疫抑制劑特別是皮質(zhì)激素，然而，大劑量的免疫制劑極易導(dǎo)感染。另一方面，免疫抑制劑的使用不足又常常導(dǎo)致移植物排斥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STAT1（Y701）磷酸化水平能夠很好地反映免疫抑制劑特別是皮質(zhì)激素（DEX）對(duì)免疫細(xì)胞的抑制情況：（1）DEX可以顯著地抑制STAT1（Y701）的磷酸化水平，并呈現(xiàn)出很強(qiáng)的濃度依賴性；（2）低劑量免疫抑制劑組合中是否含有DEX對(duì)STAT1（Y701）的磷酸化水平的抑制具有顯著的差異；

3、（3）在多種低劑量免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，比單獨(dú)使用糖皮質(zhì)激素（DEX）更能顯著地抑制STAT（Y701）的磷酸化水平。 在具體檢測(cè)方法方面，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IFN-α1刺激外周全血的淋巴細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀可以快速檢測(cè)全血樣本中淋巴細(xì)胞內(nèi)STAT1（Y701）磷酸化水平，且該方法整個(gè)操作過(guò)程僅需要3小時(shí)，從而有利于臨床醫(yī)生根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整藥物用法，指導(dǎo)臨床工作，降低排斥和感染的發(fā)生率，改善患者的存活并提高其生活質(zhì)量。因此，在評(píng)估糖

4、皮質(zhì)激素對(duì)人體免疫功能的影響方面具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單和快速的特點(diǎn)。 方法： 招募20至40歲健康志愿受試者，抽取的外周靜脈血用肝素抗凝，并真空管保存。定量的外周靜脈血與一定劑量的免疫抑制劑共培養(yǎng)30分鐘，再用刺激劑刺激15分鐘，收集細(xì)胞以備流式檢測(cè)。 磷酸化蛋白主要熒光標(biāo)記的抗體pSTAT1（Y701）-PE、細(xì)胞表面決定族抗體CD3-FITC均從BD PharMingen 公司購(gòu)買。干擾素-α1 作為STAT1（Y7

5、01）的刺激劑，購(gòu)于San Diego，CA公司。紅細(xì)胞裂解和免疫細(xì)胞固定用Lyse/Fix Buffer BD PharMingen ，而淋巴細(xì)胞破膜用Perm BufferⅢBD PharMingen 。染液是用0.2%的BSA 溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）中配置而成，用來(lái)洗滌和重懸細(xì)胞。RAPA、FK506、CsA、DEX，和MPA均廣泛應(yīng)用于臨床而被用來(lái)抑制免疫細(xì)胞活性。所有的藥物均用PBS稀釋成臨床合適的濃度。 移液器

6、每孔加入肝素化的全血50μl至96孔板（Greiner bio-one）中，并加入免疫抑制劑在37℃，5%CO2的條件下共培養(yǎng)30分鐘。再加入刺激劑（IFN-α1）刺激15分鐘。 全血培養(yǎng)后，5ul抗-CD3+加入50ul全血中培養(yǎng)10分鐘，37℃，5%CO2用1.5mlEP管收集，并加入1ml預(yù)熱的1×Lyse/Fix Buffer，10分鐘，37℃，裂解紅細(xì)胞和固定淋巴細(xì)胞。離心3分鐘，300×g，并用0.5-1ml0.2%

7、BSA染液清洗。100ul-20℃Perm BufferⅢ破膜，置于冰上30分鐘后，洗兩遍。加入5ul抗-STAT1（Y701）避光30分鐘反應(yīng)。用0.5-1ml0.2%BSA染液清洗，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 標(biāo)本用BD FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀（San Diego，CA.）檢測(cè)。CellQuest軟件用來(lái)細(xì)胞計(jì)數(shù)，每一樣本計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。FCE Express V3軟件用于流式分析。細(xì)胞百分?jǐn)?shù)作為研究對(duì)象。運(yùn)

8、用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?，LST（one-way ANOVA，LST）。 結(jié)果： 選擇流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)STAT1（Y701）磷酸化水平工具，其它方法如，為ELISA，Western Blot和Luminex技術(shù)等方法因所需的檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或不能定量等不足均未被選用。雖然IFN-α和IFN-γ2均能顯著增強(qiáng)STAT1（Y701）的磷酸化水平，但I(xiàn)FN-α1對(duì)淋巴細(xì)胞刺激效果更好，因而被選為刺激劑

9、。我們應(yīng)用不同濃度的IFN-α1（0、250、1000和2000U/ml）刺激15分鐘。試驗(yàn)結(jié)果顯示：500u/ml的IFN-α1即可較好地使STAT1（Y701）磷酸化。 STAT1（Y701）磷酸化能被高濃度（50ug/ml）的皮質(zhì)激素（DEX）明顯抑制，提示STAT1（Y701）磷酸化可作為長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用皮質(zhì)激素（DEX）導(dǎo)致的免疫力低下、極易感染的檢測(cè)指標(biāo)[11]。而高劑量的RAPA（100ng/ml）和FK506（1

10、00ng/ml）也可輕度抑制STAT1（Y701）磷酸化[17]。單用60ug/ml MPA和30ug/ml CsA很難抑制STAT1（Y701）磷酸化水平。 應(yīng)用不同濃度的DEX（0、5ug、25ug、50ug/ml）和50ul的全血共培養(yǎng)30分鐘，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)STAT1（Y701）磷酸化水平，結(jié)果顯示：DEX對(duì)STAT1（Y701）磷酸化水平具有顯著的濃度梯度抑制作用。 臨床上，包含皮質(zhì)激素的低劑量免疫抑制劑組

11、合廣泛應(yīng)用于不同階段的移植患者。因此非常有必要檢測(cè)是否合并使用皮質(zhì)激素（DEX）低濃度免疫抑制劑組對(duì)患者免疫細(xì)胞功能的影響。應(yīng)用DEX+MPA； MPA+RAPA；DEX+MPA+RAPA； MPA+FK506； DEX+MPA+FK506； MPA+CsA； MPA+CsA+DEX （DEX：5ug/ml； MPA：30ug/ml； RAPA：10ng/ml； FK506：10ng/ml；CsA：3ug/ml）和50ul的全血共培養(yǎng)

12、30分鐘，5% CO2，37℃。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)STAT1（Y701）磷酸化水平，結(jié)果顯示：加入DEX的免疫抑制劑組合的對(duì)STAT1（Y701）磷酸化具有顯著的抑制作用。 應(yīng)用不同的低濃度免疫抑制劑組合DEX； DEX+ MPA； DEX+MPA+RAPA；DEX+MPA+FK506和DEX+MPA+CsA （DEX：5ug/ml； MPA：30ug/ml； RAPA：10ng/ml； FK506：10ng/ml； CsA：3

13、ug/ml）和50ul的全血共培養(yǎng)30分鐘，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)STAT1（Y701）（Y701）磷酸化水平，結(jié)果顯示：不同的低濃度的免疫抑制劑組合相比單用DEX對(duì)STAT1（Y701）磷酸化的抑制更強(qiáng)。 結(jié)論： 最近幾十年以來(lái)，隨著器官移植技術(shù)的進(jìn)步，移植物和患者的存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)。但是，由于患者長(zhǎng)期依賴于多種免疫抑制的聯(lián)合治療，免疫抑制治療的的各種不良反應(yīng)已逐漸出現(xiàn)。但其中最主要的問(wèn)題是：（1）免疫抑制劑種類和劑量的

14、應(yīng)用是否合適；（2）如何評(píng)價(jià)患者的免疫系統(tǒng)狀態(tài)。因此若免疫抑制劑使用過(guò)量，則免疫抑制過(guò)度，易導(dǎo)致感染；相反，免疫抑制不足則易引起各種排斥反應(yīng)。目前，雖然部分免疫抑制劑的血藥濃度的檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于臨床，但此方法只能反應(yīng)個(gè)別藥物的局部劑量，卻不能反應(yīng)免疫細(xì)胞的功能。免疫抑制劑濃度高，不一定意味著免疫細(xì)胞的活性低；相反，免疫抑制劑濃度低，也不表示免疫細(xì)胞的活性高。一直以來(lái)，免疫細(xì)胞的STAT1（Y701）的磷酸化水平的檢測(cè)缺乏準(zhǔn)確而快速的檢測(cè)

15、方法，常用方法如Westernblotting只能半定量，并且耗時(shí)。相比Westernblotting，流式細(xì)胞術(shù)能更準(zhǔn)確和更敏感地檢測(cè)不同免疫細(xì)胞內(nèi)STAT1（Y701）磷酸化水平。該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)便，僅僅只需要3小時(shí)，與其他檢測(cè)方法相比大大減少了工作量和檢測(cè)時(shí)間。與此同時(shí)，標(biāo)本來(lái)源的選擇非常重要。全血標(biāo)本可最大限度地減少了體外干擾因素，更好地模仿體內(nèi)情況。因而，利用全血標(biāo)本檢測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)STAT1（Y701）磷酸化水平，能夠更準(zhǔn)確地

16、反映患者的免疫狀態(tài)。 此方法亦可應(yīng)用于腫瘤、自身免疫疾病、過(guò)敏性疾病、腎病患者和長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用皮質(zhì)激素的患者的免疫狀態(tài)的評(píng)估。目前，放化療是腫瘤患者的主要治療手段，而自身免疫疾病、過(guò)敏性疾病和腎病患者均需要大劑量應(yīng)用皮質(zhì)激素，都伴隨著免疫抑制帶來(lái)的嚴(yán)重的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此應(yīng)用STAT1（Y701）磷酸化水平評(píng)估免疫狀態(tài)可以更加合理地應(yīng)用免疫抑制療法，提高臨床治療效果。 目前，臨床廣泛應(yīng)用聯(lián)合免疫抑制治療，目的是提高免疫抑制

17、效果的同時(shí)減少副作用。而STAT1（Y701）磷酸化水平能夠反映免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的情況嗎？實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低劑量免疫抑制劑組合中是否含有DEX對(duì)STAT1（Y701）的磷酸化水平的抑制具有顯著的差異；在數(shù)種低劑量免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，糖皮質(zhì)激素（DEX）也能顯著影響STAT（Y701）的磷酸化水平。因此STAT1（Y701）磷酸化能夠很好地反映免疫抑制劑特別是皮質(zhì)激素（DEX）對(duì)免疫細(xì)胞的抑制情況。臨床醫(yī)師可以根據(jù)STAT1（Y701）