阿德福韋酯抗病毒治療病毒免疫學及與療效的關(guān)系.pdf

1、研究背景和目的：
　　 慢性乙型肝炎抗病毒治療的療效受由宿主免疫、病毒、肝臟微環(huán)境三個方面影響。核苷（酸）類似物（NA）通過抑制病毒合成來清除控制病毒，抑制病毒載量在低拷貝水平，但不能徹底清除病毒，僅有部分患者實現(xiàn)HBeAg血清學應答，而能否實現(xiàn)HBV病毒的完全清除，取決于宿主免疫應答功能的強弱。
　　 核苷（酸）類似物抗病毒治療的研究，發(fā)現(xiàn)NA抑制病毒，病毒載量下降后，部分患者出現(xiàn)HBV特異性T細胞功能的一過性增強，并

2、且與HBeAg陰轉(zhuǎn)密切相關(guān)。慢乙肝患者急性發(fā)作，自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換前，可出現(xiàn)HBcAg特異的CD4+T細胞應答的顯著增強。這提示抗病毒治療能否實現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，是與HBV特異性T細胞功能的恢復程度相關(guān)。因此，核苷（酸）類似物治療CHB患者,其治療前后的病毒免疫表達狀態(tài)，相互間的作用，與HBeAg陰轉(zhuǎn)的相關(guān)性是抗病毒治療免疫學機制的重要內(nèi)容。
　　 肝臟是HBV主要的受累器官，在肝臟局部的免疫細胞和細胞因子等是抗病毒治療

3、的主要效應因子，抗病毒治療后，肝臟局部的病毒清除、免疫細胞、免疫因子的數(shù)量和功能的改變對抗病毒的療效起了重要作用。充分闡明肝臟局部抗病毒治療的病毒免疫學機制，尋求理想的治療方法提高療效具有重大意義。
　　 1．動態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，其外周血和肝臟局部病毒的清除動力學：（1）外周血HBVDNA、HbeAg水平的動態(tài)變化，與臨床療效的相關(guān)性（2）比較抗病毒治療的病毒動力學的早期階段（0-12周），

4、HBeAg陰轉(zhuǎn)患者和HBeAg未陰轉(zhuǎn)患者在治療前后肝臟病毒（HBVDNA和cccDNA）載量的差異；對HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的直接影響。
　　 2．動態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，伴隨病毒下降的過程，宿主外周血和肝臟局部特異性和非特異性免疫細胞的動態(tài)改變（1）外周血HBV特異性T細胞功能、Treg細胞以及NK細胞活化受體NKG2D表達的動態(tài)變化，（2）肝臟局部免疫細胞和免疫因子在病毒動力學早期階段的改變，

5、進一步探討抗病毒治療后免疫功能恢復的機制，與HbeAg血清學應答的相關(guān)性。
　　 3．評估治療前病毒免疫狀態(tài)和早期病毒學應答對遠期療效的預測價值，以進一步闡明臨床抗病毒治療預測指標的預測價值。
　　 研究方法：
　　 入選13例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者，符合2005年中華醫(yī)學會感染病分會及肝病分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準。所有患者均予阿德福韋酯治療10mg/天，隨訪治療1年。在治療前、治療后

6、2W、4W、8W、12W、16W、20W、24W、36W、50W留取肝素抗凝全血作為隨訪檢測標本，部分全血分離外周血單核細胞凍存，分批進行檢測。其中8例患者治療前和治療后12周各行肝活檢一次，留取肝組織樣本進行檢測。
　　 1．監(jiān)測抗病毒治療過程血清HBV-DNA、HBeAg的水平，BrdU淋巴細胞增殖試驗檢測相應隨訪時間點的T細胞增殖率，酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測分泌干擾素-γ的HBV特異性CD4+T細胞頻數(shù)，以評價抗病毒治療后病毒

7、的下降對HBV特異性T細胞功能的影響。
　　 2．多色流式細胞術(shù)檢測抗病毒治療過程，CD4＋CD25＋Treg細胞數(shù)量和NK細胞活化受體NKG2D的表達。
　　 3．實時熒光定量PCR檢測治療前和治療后12周肝臟組織病毒（cccDNA、HBVDNA）載量，比較治療前后肝臟組織病毒的下降程度。
　　 4．免疫組化法分析治療前和治療后12周肝臟組織免疫細胞（CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞）和細胞因子干擾素-

8、γ的動態(tài)表達。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分
　　 1．臨床療效：阿德福韋酯有效的抑制了CHB患者的病毒復制，治療50周時，13例患者有9例血清HBVDNA低于檢測值下（9/13,69％）；有4例出現(xiàn)HBeAg的陰轉(zhuǎn)（4/13，30％），其中2例出現(xiàn)Anti-Hbe，實現(xiàn)血清學轉(zhuǎn)換（2/13，15％）。將患者分為HBeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組兩組，至36周和50周時，HBeAg陰轉(zhuǎn)組血清HBVDNA下降較H

9、BeAg未陰轉(zhuǎn)組顯著（P=0.025，P=0.022）。
　　 2.伴隨病毒載量的下降，HBeAg陰轉(zhuǎn)組治療后抗原特異性CD4+T細胞分泌IFN-γ能力較治療前增強（P＜0.05），分別在治療12周和出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)時達到高峰，而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組治療后較治療前無顯著增強。與HBeAg未陰轉(zhuǎn)組比較，在治療前和治療后各隨訪點，HBeAg陰轉(zhuǎn)組HBV抗原特異性CD4+T細胞分泌IFN-γ能力都較前者顯著增強。HBeAg陰轉(zhuǎn)組治療后

10、HBV抗原特異性T細胞增殖能力有一過性增強，而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組無T細胞增殖應答。表明病毒載量下降后，HBV特異性T細胞功能恢復的患者，可實現(xiàn)HBeAg血清學應答。
　　 3.伴隨血清HBV-DNA的下降，Treg在0-4周間有明顯下降，4周后處于穩(wěn)態(tài)，不再下降；HBV-DNA和Treg之間呈正相關(guān)性趨勢（r=0.808，P=0.000）；在HBeAg轉(zhuǎn)換組和HBeAg未轉(zhuǎn)換組間下降趨勢和幅度沒有顯著差異。
　　 4.N

11、K細胞活化受體NKG2D在治療后8周開始上升，12周時增高已有顯著性差異（8.12±4.74vs3.95±1.15，P=0.009）；50周較基線值顯著增加(17.52±6.81vs3.95±1.15，P=0.000)，約增加了5倍。NKG2D和HBVDNA、HBeAg間呈負性相關(guān)趨勢（分別是r=-0.734，P=0.000；r=-0.878，P=0.000）。HbeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組在各個時間隨訪點變化趨勢和增加幅度一致，

12、二者間無顯著差異。
　　 第二部分
　　 1.治療12周后肝組織總HBVDNA減少量為86.22％-99.69％，平均97.98％；肝組cccDNA減少量為88.16％-99.98％，平均97.82％。由此可見， 近98％左右的肝臟病毒載量在治療的早期被清除。同步比較治療前后外周血HBVDNA（12周vs0周：2.81×104vs1.00×107）平均降低99.72％，肝臟局部和外周血病毒的清除動力學相一致。
　　

13、 2．治療前HBeAg陰轉(zhuǎn)組的肝組織HBV DNA和cccDNA水平均低于HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（HBV DNA：2.39×108vs5.67×108 copies/ug；cccDNA：4.77×104vs7.98×104 copies/ug）,治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)組的cccDNA水平低于HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（5.50×102vs1.93×103）。這提示治療前肝組織HBVDNA和cccDNA載量較低或治療后肝組織cccDNA明顯下降的患者

14、，其遠期實現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)的機會較高。
　　 3．所有患者治療后（12周）較治療前（0周）肝臟炎癥明顯減輕，匯管區(qū)縮小，淋巴單核浸潤細胞減少。肝小葉點狀壞死、碎屑樣壞死、橋形壞死不同程度減輕。部分患者纖維化改善?？共《局委熀螅《竞铣杀灰种?，肝組織炎癥纖維化明顯好轉(zhuǎn)。
　　 4．部分患者治療后肝組織CD8+T細胞和NK細胞的平均陽性面積和匯管區(qū)陽性細胞數(shù)較治療前增加。3例HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者，有1例CD4+T/CD8+T

15、/NK細胞數(shù)治療后均較治療前增加，另外2例CD8+T/NK細胞數(shù)較治療前增加；5例HBeAg未陰轉(zhuǎn)患者僅1例CD8+T/NK細胞數(shù)較治療前增加。這提示治療后肝組織免疫效應細胞的增加，促使抗病毒免疫功能的恢復，有利于HBeAg的陰轉(zhuǎn)。
　　 5．治療后肝組織IFN-γ的表達量較治療前下降（12周vs0周：1282.49±528.32vs2012.49±971.53，P=0.031）。IFN-γ的表達和CD4+T細胞呈正相關(guān)性（pe

16、arson 檢驗R=0.591， P=0.026）
　　 結(jié)論：
　　 1.抗病毒治療的早期階段，肝臟組織有約97％的病毒（HBVDNA和cccDNA）被清除，與外周血病毒清除動力學一致。治療前肝組織HBVDNA和cccDNA的低表達，以及治療12周時cccDNA的顯著清除均有利于宿主HbeAg的陰轉(zhuǎn)。
　　 2.阿德福韋酯抗病毒治療，病毒抑制，炎癥減輕，HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者早期免疫功能的恢復與肝臟局部CD8+T