茶多酚在同型半胱氨酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)改變中的作用.pdf

1、目的： 動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS) 是一種血管壁應(yīng)對(duì)各種引起粥樣硬化因素的特殊類(lèi)型慢性炎癥。在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、脂質(zhì)和纖維成分的增加，當(dāng)它們的數(shù)量積聚到一定程度時(shí)，即會(huì)出現(xiàn)臨床心腦血管病變。細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAMs)是一類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合，起粘附作用的糖蛋白，它們?cè)趧?dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)水平和

2、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相一致，并被認(rèn)為參與了動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病過(guò)程。同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，在高濃度作用下可導(dǎo)致白細(xì)胞粘附及游出血管內(nèi)皮層，其已被證實(shí)是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是從綠茶中提取的多酚類(lèi)化合物復(fù)合體，它有多種藥理作用，表現(xiàn)出廣泛的生物活性。大量研究表明，其具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病等作用。本實(shí)驗(yàn)將病理生理濃度的Hcy作用于人臍靜脈內(nèi)

3、皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，觀(guān)察了Hcy對(duì)HUVEC的生長(zhǎng)抑制作用，并通過(guò)在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平粘附分子和氧化相關(guān)蛋白的檢測(cè)和分析，探討同型半胱氨酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制，在此基礎(chǔ)上研究茶多酚能否抑制Hcy引起的粘附分子表達(dá)，探討其發(fā)揮藥理學(xué)作用的機(jī)制，為茶多酚進(jìn)一步廣泛應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。尋找有效降低動(dòng)脈粥樣硬

4、化發(fā)生的干預(yù)措施，并為茶多酚的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 復(fù)蘇后HUVEC置于37℃，5﹪CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC分為對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：茶多酚組、Hcy組、Hcy+茶多酚組。 茶多酚和Hcy在培養(yǎng)體系中的終濃度分別為25mg/L和50mmol/L對(duì)照組加入等體積的PBS。加入茶多酚和Hcy培養(yǎng)24h后，采用四唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazoliu

5、m，MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性，分別采用十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及Westernblotting、免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析粘附分子ICAM-1和E-selectin的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Rvvvrsv transcription polymerase chain reaction,RT-P

6、CR)檢測(cè)ICAM-1和E-selectin mRNA水平的改變以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、血管舒張因子一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、一氧化氮合酶(NOS)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-PX)水平的測(cè)定。 結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察鏡下可見(jiàn)，HCY組細(xì)胞數(shù)量最少，形態(tài)最不規(guī)則、體積增大、立體感最差；TP組與HCY組細(xì)胞相

7、比，細(xì)胞數(shù)量增多、體積減小、立體感增強(qiáng)、形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)顆粒減少，但與正常組相比，仍有一定差別。 2．茶多酚和Hcy對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響HUVEC給予Hcy和/或茶多酚處理24h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，Hcy可明顯抑制HUVEC的生長(zhǎng)(36.0﹪，P<0.05)，加入茶多酚后則明顯降低Hcy所致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(7.9﹪，P>0.05)。 3．SDS-PAGE及Westem blot方法檢測(cè)粘附分子ICAM-1

8、和E-selectin的表達(dá)與對(duì)照組相比，Hcy組細(xì)胞ICAM-1和E-selectin表達(dá)分別升高30﹪和34﹪(P<0.05)。同時(shí)給予茶多酚后，ICAM-1和E-selectin表達(dá)分別降低16﹪和30﹪(P<0.05)。 4．免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)粘附分子ICAM-1和E-selectin的表達(dá)ICAM-1和E-selectin表達(dá)主要都是在細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)處，對(duì)照組中ICAM-1和E-selectin染色均較淺；Hcy

9、組中細(xì)胞雖然數(shù)量減少，且發(fā)生了形態(tài)學(xué)方面的改變，但其染色相對(duì)仍較多較重，與對(duì)照組相比，Hcy組細(xì)胞ICAM-1和E-selectin表達(dá)分別升高30﹪和37﹪(P<0.05)；茶多酚與Hcy共同培養(yǎng)后，ICAM-1和E-selectin表達(dá)分別下降了17﹪和24﹪(P<0.05)。5.RT-PCR檢測(cè)粘附分子ICAM-1和E-selectin的mRNA水平的變化 Hcy能顯著升高HUVEC ICAM-1 mRNA水平(67﹪，P<0.0

10、1)，升高E-selecfin mRNA水平較大417﹪(P<0.01)。茶多酚與Hcy共同作用以后，ICAM-1 mRNA水平降低了37﹪(P<0.01)，E-selectin mRNA水平降低44﹪(P<0.01)。 5.MDA、NO、NOS和GSH-PX濃度的測(cè)定與對(duì)照組相比，Hcy組培養(yǎng)液中MDA含量增加(P<0.05)、NO含量降低(P<0.05)、NOS活性降低(P<0.05)和GSH-PX濃度變化不明顯(P>0.0

11、5)；加入茶多酚后，與Hcy組相比，培養(yǎng)液中MDA含量降低(P<0.05)、NO含量升高(P<0.05)、NOS活性升高(P<0.05)但GSH-PX濃度變化不明顯(P>0.05)。 結(jié)論： 1.病理生理劑量的Hcy可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。 2.Hcy誘導(dǎo)HUVEC中ICAM-1和E-selectin的表達(dá)升高，這與mRNA水平改變有關(guān)。 3.Hcy誘導(dǎo)HUVEC中ICAM-1和E-scl