Toll樣受體亞型單一和聯(lián)合基因沉默穩(wěn)定易損斑塊的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。研究表明，伴有免疫反應(yīng)的炎癥過程貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的始終。炎性細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)程中扮演了重要角色。血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及外膜的成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞均可作為免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。 但在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展中，其發(fā)病分子機(jī)制至今尚未闡明。近年來(lái)，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在

2、炎癥反應(yīng)與天然（固有）和獲得性（適應(yīng)性）免疫反應(yīng)中的作用日益受到人們的重視。Toll蛋白是最先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與對(duì)細(xì)菌和真菌的識(shí)別及病原體的清除。隨后，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的與Toll相似的跨膜蛋白被稱為Toll樣受體。TLRs能識(shí)別種類繁多的一病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），屬于模式識(shí)別受體。目前為止，人類TLR家族至少有11名成員已被發(fā)現(xiàn)

3、。不同的PAMP活化人類TLR家族的不同成員。TLRs通過其跨膜結(jié)構(gòu)將LPS信號(hào)傳遞入細(xì)胞內(nèi)，級(jí)聯(lián)式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白MyD88、白介素1受體激酶（IRAK）、腫瘤壞死因子6調(diào)節(jié)蛋白（TRAF6）和NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK），進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，引起細(xì)胞因子的釋放而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。啟動(dòng)炎癥因子的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的作用。 AS的整個(gè)過程是炎癥和免疫反應(yīng)的過程，而TLRs能夠介

4、導(dǎo)天然性和獲得性免疫反應(yīng)，因此，TLRs與AS的關(guān)系正逐漸引起人們的重視。大量研究證實(shí)TLR1、TLR2、TLR4、TLR6等TLRs家族成員在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起到了重要作用，在人類和動(dòng)物的AS斑塊中已檢測(cè)出上述TLRs的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表達(dá)TLR2和TLR4，這兩種受體的表達(dá)量隨病變的進(jìn)展而增加，并且TLRs調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、斑塊穩(wěn)定性以及血管重塑等AS病理過程。 本

5、課題開展了應(yīng)用RNAi技術(shù)，單獨(dú)或聯(lián)合沉默LR2和TLR4基因，阻止AS進(jìn)程，穩(wěn)定易損斑塊的研究。 目的: 1.慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)TLR2和TLR4基因設(shè)計(jì)siRNA相應(yīng)的DNA片段，分子克隆到BLOCK-It Lentiviral PolⅡ miR RNAi表達(dá)載體； 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究TLR2i和LTR4i對(duì)于阻止AS進(jìn)程，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的療效； 3.聯(lián)合應(yīng)該用TLR2i和LTR4i

6、，對(duì)比研究聯(lián)合干擾和單一干擾對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的穩(wěn)定作用。 方法: 1.RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建以及有效靶點(diǎn)的篩選： 1.1分別構(gòu)建TLR2和TLR4基因的小分子干擾RNA載體的構(gòu)建： 設(shè)計(jì)、合成分別特異性針對(duì)小鼠TLR2和TLR4基因的小分子干擾RNA序列（各3段序列），以BLOCK-It Lentiviral PolⅡ miR RNAi為母本，分別構(gòu)建小分子干擾RNA載體BLOCK-TLR2-A、BLO

7、CK-TLR2-B、BLOCK-TLR2-C、BLOCK-TLR4-A、BLOCK-TLR4-B、BLOCK-TLR4-C，DNA序列測(cè)定鑒定重組質(zhì)粒的正確性。 1.2慢病毒干擾載體的構(gòu)建及體外擴(kuò)增： 將已構(gòu)建好的上述6個(gè)穿梭質(zhì)粒和對(duì)照載體BLOCK-mock，與攜帶CMV啟動(dòng)子的BLOCK-It Lentiviral PolⅡ miR表達(dá)載體進(jìn)行rapid BP/LR重組，繼而與293FT包裝細(xì)胞結(jié)合形成病毒表達(dá)載體。

8、 1.3有效封閉TLR2和TLR4基因表達(dá)的RNA干擾慢病毒載體的篩選： 將mock-LV、TLR2i-siteA、TLR2i-siteB、TLR2i-siteC、TLR4i-siteA、TLR4i-siteB、TLR4i-siteC的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞。熒光定量RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞TLR2和TLR4 mRNA水平、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，篩選出有效阻斷TLR2

9、，TLR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體。 2.RNA干擾慢病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：頸動(dòng)脈套管手術(shù)8周后，將10μL的LV-mock病毒懸液，10μL的LV-TLR2病毒懸液，10μL的LV-TLR4病毒懸液，5μL的LV-TLR2病毒懸液聯(lián)合5μL的LV-TLR4病毒懸液，局部轉(zhuǎn)染右頸動(dòng)脈斑塊，根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒不同，各組分別命名：空載體組（n＝28），TLR2干擾組（n＝28），TLR2干擾組（n＝28）和TLR2+4聯(lián)合干擾組（n＝2

10、8）。另28只未轉(zhuǎn)染病毒的小鼠歸為對(duì)照組。我們將，TLR2干擾組，TLR4干擾組和TLR2+4聯(lián)合干擾組統(tǒng)稱為干擾組；對(duì)照組和空載體組稱為非干擾組。病毒轉(zhuǎn)染一周后和二周后空載體組分別處死3只動(dòng)物，檢測(cè)斑塊內(nèi)內(nèi)GFP的表達(dá)。其余實(shí)驗(yàn)鼠于轉(zhuǎn)染四周后處死，觀察斑塊內(nèi)GFP的表達(dá)，檢測(cè)斑塊的病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)。 3.血液生化指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C

11、）的水平。 4.病理學(xué)檢測(cè)：對(duì)頸動(dòng)脈斑塊分別進(jìn)行H&E染色、油紅O染色、天狼猩紅染色，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞（MOMA-2）、平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）的表達(dá)。測(cè)量斑塊面積和纖維帽的厚度，觀察斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原、脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的含量，計(jì)算易損指數(shù)：易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)）陽(yáng)性面積百分比/（平滑肌細(xì)胞+膠原）陽(yáng)性面積百分比。 5.動(dòng)脈斑塊內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的檢查：用2.5％

12、戊二醛固定新鮮頸動(dòng)脈斑塊，脫水，浸透包埋，制作超薄切片，染色后投射電鏡觀察拍片。 6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)：取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)斑塊內(nèi)β-actin，TLR2，TLR4，IL-1β，IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA的表達(dá)水平。 7.Western blot檢測(cè)：取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)斑塊內(nèi)β-actin，TLR2， TLR

13、4。 結(jié)論: 1.本研究成功地應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)小鼠TLR2和TLR4基因的慢病毒干擾載體。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR2和TLR4基因沉默能有效的抑制斑塊局部TLR2和TLR4基因的表達(dá)，顯著減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量，降低斑塊內(nèi)炎癥因子的表達(dá)，從而抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。 3.聯(lián)合應(yīng)用TLR2干擾和TLR4干擾，能夠更有效的增加斑塊的穩(wěn)定性。TLR2和TLR4之間在動(dòng)脈粥樣硬化