Hras12V轉基因小鼠雌雄差異性肝腫瘤發(fā)生的蛋白質組學分析.pdf

1、目的:
　　肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟協(xié)同的復雜過程?，F(xiàn)有研究表明，男性是肝癌發(fā)生的獨立風險因素，但其具體機制尚不清楚。本研究旨在對Hras12V轉基因小鼠性別差異性肝腫瘤發(fā)生的蛋白質組學進行分析，探究肝腫瘤發(fā)生發(fā)展性別依賴的分子機制。
　　方法:
　　通過對Hras12V原癌基因在肝細胞中的特異性表達誘導形成的轉基因肝癌小鼠模型進行研究，探索性別差異性肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白質組學的特點。
　　1.對H-r

2、as12V轉基因肝癌小鼠及正常C57BL/6J（10月齡雄性、10月齡雌性、15月齡雌性，各組9只，共計54只）小鼠進行剖檢，觀察和統(tǒng)計肝臟的病變情況;應用HE染色，檢測小鼠肝組織病理變化情況。
　　2.對上述病理證實的正常小鼠肝組織及Hras12V小鼠肝腫瘤組織及腫瘤周圍組織（10月齡雄鼠和15月齡雌鼠）進行蛋白質的提取。用Western blot方法檢測磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-MEK)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p

3、-ERK1/2）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白水平。
　　3.對上述病理證實的正常小鼠肝組織及Hras12V小鼠腫瘤組織及腫瘤周圍組織(10月齡雄鼠和15月齡雌鼠，各組3只，共計12只)進行蛋白質提取。用2D-DIGE方法檢測正常組織、腫瘤周圍組織和腫瘤組織中蛋白質變化情況。
　　4.在上述檢測的差異蛋白點中，隨機選擇180個差異

4、蛋白點，應用MALDI-TOF/TOFMS進行蛋白質鑒定。
　　5.在上述鑒定差異蛋白中，隨機選擇7個蛋白(HSP90B1、β-actin、Albumin、APOA1、CALR、FABP5和PRDX6)，應用Western blot方法進行驗證。
　　6.使用DAVID和UniProt工具對差異蛋白進行GO和KEGG分析。
　　結果:
　　1.病理檢測結果表明:Hras12V誘導的肝癌小鼠模型，在10月齡雄性和1

5、5月齡雌性小鼠中出現(xiàn)了多發(fā)性肝腫瘤，而在10月齡Hras12V雌性轉基因小鼠和正常C57BL/6J雌雄小鼠肝組織中均未發(fā)生腫瘤。腫瘤個數(shù)統(tǒng)計結果表明，10月齡Hras12V雄性小鼠＜5mm，5-10mm，＞10mm肝腫瘤都顯著多于15月齡Hras12V雌性小鼠，而10月齡雌性小鼠僅有少量＜5mm的小結節(jié)發(fā)生。
　　2.Western檢測結果表明，雌雄小鼠肝腫瘤組織中的p-MEK激活程度無顯著差異，而p-ERK、p-AKT和p-mT

6、OR激活程度在雌鼠肝腫瘤組織中的激活程度都顯著高于雄鼠，而p-PI3K的激活程度是雄鼠顯著高于雌鼠。
　　3.2D-DIGE檢測結果表明，在所有檢測2D-DIGE膠中發(fā)現(xiàn)2381個差異蛋白點。腫瘤組織和腫瘤周圍組織與正常組織相比，雄鼠的差異蛋白點個數(shù)顯著高于雌鼠。腫瘤周圍組織與正常組織相比，雌鼠的差異蛋白點個數(shù)顯著高于雄鼠。
　　4.MALDI-TOF/TOF MS鑒定180個蛋白點，共鑒定到89個差異蛋白，且差異蛋白個數(shù)的

7、變化趨勢與2D-DIGE差異蛋白點個數(shù)的變化趨勢一致。
　　5.Western blot檢測結果表明，在雄性小鼠中，7個差異蛋白與2D-DIGE檢測趨勢一致;在雌性小鼠中，6個差異蛋白與2D-DIGE檢測趨勢一致，僅有PRDX6不一致。
　　6.生物信息學分析結果表明，雌鼠差異蛋白多集中在HCC相關蛋白模式中;雄鼠差異蛋白多集中在RAS相關蛋白模式中。
　　結論:
　　1.Hras12V誘導的肝癌小鼠模型，肝腫瘤