p52SHC1和p52SHC3對(duì)神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞和PC12細(xì)胞周期的影響研究.pdf

1、成年動(dòng)物的神經(jīng)元已經(jīng)退出細(xì)胞周期，不再具有分裂增殖的能力。有報(bào)道認(rèn)為同源分子SHCI和SHC3在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布截然相反，前者僅存在于神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞，后者僅存在于分裂后的神經(jīng)元。此發(fā)現(xiàn)為研究神經(jīng)元脫離細(xì)胞周期的分子機(jī)理提供契機(jī)。因此我們希望通過(guò)研究SHCI和SHC3對(duì)可分裂細(xì)胞(如NSC)和不可分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元）細(xì)胞周期的影響，解釋神經(jīng)元為何脫離細(xì)胞周期。在此目的下，本文主要探討分別干涉SHC3和SHC1或者分別表達(dá)SHC1和S

2、HC3對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞周期的影響，研究過(guò)表達(dá)SHC1和SHC3及其結(jié)構(gòu)域?qū)C12細(xì)胞周期的影響，揭示SHC3的CH1+SH2結(jié)構(gòu)域促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖的分子機(jī)理。
　　 本文的研究主要分為以下3部分：
　　 第一部分：SHC1和SHC3對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞周期的影響研究。在研究SHC1和SHC3對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞周期的影響時(shí)，我們首先從胎鼠中分離并純化了皮層神經(jīng)元，進(jìn)一步的SHC3染色顯示神經(jīng)元的純度在99％以上，然后用

3、慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默神經(jīng)元中SHC3 mRNA，用腺病毒在神經(jīng)元中表達(dá)SHC1。SHC3mRNA干涉后，部分神經(jīng)元進(jìn)入細(xì)胞周期并伴隨著Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、CDK2和磷酸化CDK2(p-CDK2)表達(dá)高調(diào)；表達(dá)SHC1后，神經(jīng)元細(xì)胞周期沒(méi)有發(fā)生變化，但是Cyclin A、CDK2和p-CDK2的表達(dá)出現(xiàn)高調(diào)。在研究SHC1和SHC3對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)周期的影響時(shí)，我們首先從胎鼠皮層中分離并鑒定了

4、大鼠NSC，然后用慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默神經(jīng)干細(xì)胞中的SHC1，用腺病毒在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)SHC3。SHC1 mRNA干涉后，神經(jīng)干細(xì)胞周期被抑制伴隨著Cyclin E和CyclinA表達(dá)下調(diào)；表達(dá)SHC3后，神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯并伴隨著Cyclin D1、Cyclin E和Cyclin A表達(dá)下調(diào)。
　　 第二部分：SHC1、SHC3及其結(jié)構(gòu)域?qū)C12細(xì)胞周期的影響。我們成功克隆了小鼠p52SHC1和p52SHC3的

5、ORF，構(gòu)建了SHC1、SHC1-PTB、SHC1-PTB+CH1、 SHC1-SH2、 SHC1-CH1+SH2、 SHC3、 SHC3-PTB、SHC3-PTB+CH1、SHC3-SH2、SHC3-CH1+SH2的真核表達(dá)載體，利用上述真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot分別檢測(cè)了過(guò)表達(dá)以上蛋白對(duì)PC12細(xì)胞周期和細(xì)胞周期蛋白的影響。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36h和60h的PC12細(xì)胞

6、中，CH1結(jié)構(gòu)域的存在會(huì)影響PTB結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域的功能，因此在比較PTB和SH2結(jié)構(gòu)域的功能時(shí)，必須考慮CH1結(jié)構(gòu)域的存在。流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)的結(jié)果表明：SHC1提高了CDK2的表達(dá)，促使G0/G1期細(xì)胞數(shù)目減少，SHC3則降低了Cyclin D1和CyclinA的表達(dá)，使細(xì)胞滯留在G0/G1期；SHC1的PTB結(jié)構(gòu)域能促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)，降低Cyclin A的表達(dá)，但是對(duì)G0/G1期細(xì)胞數(shù)目影響不

7、明顯，而SHC3的PTB結(jié)構(gòu)域則能降低Cyclin A、Cyclin D1和Cyclin E的表達(dá)，使得G0/G1期的細(xì)胞比例上升：SHC1和SHC3的SH2結(jié)構(gòu)域均能上調(diào)Cyclin D1和Cyclin E的表達(dá)，降低G0/G1期細(xì)胞的數(shù)量，但是SHC3的SH2結(jié)構(gòu)域還能提高CDK2的表達(dá)，因此其造成的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)要比前者大。比較不同結(jié)構(gòu)域引起的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，對(duì)不同分子來(lái)說(shuō)，SHC3的PTB結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域要大于SHC1的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域；

8、在同一分子中，對(duì)SHC1來(lái)說(shuō)，SH2結(jié)構(gòu)域和PTB結(jié)構(gòu)域的作用差別不明顯，對(duì)SHC3而言，PTB結(jié)構(gòu)域的功能大于SH2結(jié)構(gòu)域。
　　 第三部分：SHC3的SH2結(jié)構(gòu)域影響PC12細(xì)胞周期的分子機(jī)理。首先我們使用計(jì)算生物學(xué)的方法預(yù)測(cè)了CH1結(jié)構(gòu)域以不同方式結(jié)合對(duì)其與GRB2結(jié)合力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CH1結(jié)構(gòu)域以正向（從N．末端到C-末端）方式結(jié)合的結(jié)合能要小于其以反向（從C-末端到N-末端）方式結(jié)合的結(jié)合能，而GRB2參與的信號(hào)通路

9、與細(xì)胞增殖正相關(guān)，這就導(dǎo)致結(jié)合力越大促進(jìn)細(xì)胞增值的能力越強(qiáng)。然后我們使用PCR擴(kuò)增了SHC3的SH2結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域，人為將兩者的位置顛倒，即由原來(lái)的CHI+SH2（反向）變?yōu)镾H2+CH1（正向），構(gòu)建了pEGFP-SH2+CH1真核表達(dá)載體。最后將pEGFP-CH1+SH2和pEGFP-SH2+CH1轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，使用Co-IP檢測(cè)CHI+SH2以及SH2+CH1與內(nèi)源性GRB2的結(jié)合力差別，流式細(xì)胞術(shù)和WesternBlo

10、t分別檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化。Co-IP檢測(cè)顯示，CH1+SH2與GRB2的結(jié)合力要遠(yuǎn)大于SH2+CH1的結(jié)合力。流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)證明CH1+SH2提高了Cyelin D1、Cyclin E和CDK2的表達(dá)，促使G0/G1期細(xì)胞數(shù)目減少，說(shuō)明CH1+SH2能促進(jìn)PC12細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，而SH2+ CH1則降低了CyclinA、Cyclin D1和Cyelin E的表達(dá)，使G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增加，

11、說(shuō)明SH2+ CH1抑制了PC12細(xì)胞的增殖。
　　 對(duì)比研究SHC1和SHC3對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞周期的影響，我們發(fā)現(xiàn)SHC3在維持神經(jīng)元的靜息狀態(tài)中起著極其重要的作用，它有可能為眾多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾患的治療提供可能的作用靶點(diǎn)。過(guò)表達(dá)SHC1、SHC3及其結(jié)構(gòu)域?qū)C12細(xì)胞周期影響的研究初步解釋了在脫離細(xì)胞周期中SHC3的PTB結(jié)構(gòu)域?qū)λ墓δ芷鹬饕饔?。?duì)SHC3的SH2結(jié)構(gòu)域影響PC12細(xì)胞周期分子機(jī)理的研究證