基質(zhì)輔助激光解析離子化研究及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、本論文以基質(zhì)輔助激光解析離子化(MALDI)技術(shù)為主要研究對(duì)象,通過對(duì)該技術(shù)光電化學(xué)原理的探討,發(fā)展了一系列基于半導(dǎo)體材料基底的離子源內(nèi)氧化還原反應(yīng),并將這些反應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。此外,基于MALDI技術(shù),本論文還研究了磷酸化肽段的MALDI靶板原位富集分析以及蛋白質(zhì)在介孔材料內(nèi)的快速酶解鑒定。
　　 論文的第一章概述了生物質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)近年來的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。包括基質(zhì)輔助激光解析離子化原理研究、無(wú)機(jī)光敏基底輔助的激光

2、誘導(dǎo)樣品離子化、納米氧化鈦等無(wú)機(jī)半導(dǎo)體材料的光電化學(xué)性質(zhì)、基于質(zhì)譜的各種樣品碎裂技術(shù)、肽段標(biāo)記技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)后修飾研究以及固定化酶技術(shù)用于蛋白快速酶解。
　　 本論文研究工作分為三章,基于激光解析離子化(LDI)技術(shù)的光電原理,發(fā)展了一系列由半導(dǎo)體材料納米氧化鈦誘發(fā)的源內(nèi)氧化還原反應(yīng),用于肽段的在線標(biāo)記、二硫鍵的在線還原以及肽段的源內(nèi)氧化a,x裂解;以蛋白質(zhì)后修飾為研究對(duì)象,發(fā)展了磷酸化肽段的MALDI靶板原位富集和分析;以蛋

3、白質(zhì)快速結(jié)構(gòu)分析為目標(biāo),發(fā)展了基于介孔材料納米限域效應(yīng)的蛋白質(zhì)高效酶解鑒定。具體內(nèi)容如下:
　　 (一)激光解析離子化過程的源內(nèi)光電化學(xué)反應(yīng)研究及其應(yīng)用
　　 在第二章中,我們?cè)O(shè)計(jì)研制了納米氧化鈦修飾的MALDI靶板。通過將納米氧化鈦粒子沉積在一塊不銹鋼靶板上形成陣列式的靶點(diǎn),再將這些點(diǎn)在高溫下燒結(jié),就可以得到一系列具有光敏性能的靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)可以作為多孔的基底用于沉積樣品。在激光解析(LDI)離子化過程中,這些基底中能

4、夠形成大量的氧化還原中心用于誘發(fā)各種各樣的源內(nèi)反應(yīng)。此外由于這些靶點(diǎn)由納米粒子構(gòu)成,具有很大的比表面積,因而具有很強(qiáng)的光致氧化還原能力。利用這一原理,我們先后進(jìn)行了在線的半胱氨酸氧化標(biāo)記反應(yīng)、肽段氧化裂解反應(yīng)以及二硫鍵的還原斷裂反應(yīng)。
　　 1.基于基質(zhì)輔助激光解析離子化過程光電化學(xué)原理的半胱氨酸源內(nèi)標(biāo)記
　　 在本節(jié)中,對(duì)苯二酚作為一個(gè)氧化還原介體被加入到樣品中。在激光的作用下,光致產(chǎn)生的氧化性空穴可以將對(duì)苯二酚氧化成

5、對(duì)苯醌,之后對(duì)苯醌可以與半胱氨酸的巰基發(fā)生加成反應(yīng)從而達(dá)到半胱氨酸的標(biāo)記,標(biāo)記后得肽段可以與未標(biāo)記的樣品一起進(jìn)入質(zhì)量分析器得到檢測(cè),通過在質(zhì)譜圖上查找具有對(duì)苯醌分子量加成的一對(duì)峰就可以得到關(guān)于肽段內(nèi)半胱氨酸含量的信息。通過選擇性的在線標(biāo)記半胱氨酸,可以快速的將目標(biāo)肽段從混合樣品中分析出來,該方法還可用于在線的計(jì)數(shù)某一肽段中半胱氨酸的數(shù)目。在數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索過程中,如果只提供分子量這一個(gè)信息,則必須達(dá)到精確度很高的質(zhì)譜檢測(cè)核質(zhì)比才能夠得到較為

6、精確的檢索結(jié)果。通過附加其他有意義的信息,可以大大的提高數(shù)據(jù)檢索的置信度。利用這種源內(nèi)的半胱氨酸氧化標(biāo)記,可以在得到目標(biāo)肽段核質(zhì)比的同時(shí)也得到該肽段內(nèi)半胱氨酸的含量信息,通過附加這種信息,樣品鑒定的得分可以被極大地提高。并以beta乳球蛋白和牛血清白蛋白以及蛋白混合物為例,對(duì)這些原理加以論證。
　　 2.基于激光解析離子化過程中光催化還原反應(yīng)用于二硫鍵源內(nèi)斷裂
　　 通常情況下認(rèn)為半導(dǎo)體納米氧化鈦在激光輻射下主要會(huì)體現(xiàn)很

7、強(qiáng)的氧化性,價(jià)帶空穴所體現(xiàn)的氧化能力比導(dǎo)帶電子的還原能力要強(qiáng)很多,因此長(zhǎng)期以來關(guān)于光催化還原反應(yīng)的研究相對(duì)很少。通過添加各種電子給體,可以大大抑制光生電子在材料內(nèi)部和表面的淬滅,從而提高體系的還原性。通過添加電子給體葡萄糖,首次實(shí)現(xiàn)了無(wú)有機(jī)基質(zhì)激光解析離子化(LDI)源內(nèi)的光催化還原反應(yīng)。我們以二硫鍵的還原為例說明了這種源內(nèi)還原反應(yīng)。二硫鍵的形成對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)具有很重要的意義,為了實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)的分析必須通過還原反應(yīng)打開二硫鍵。

8、傳統(tǒng)的二硫鍵還原反應(yīng)主要是在溶液相中進(jìn)行,最近,田中耕一報(bào)道了一種新穎的還原性基質(zhì),1,5-二胺基萘,并將該基質(zhì)用于實(shí)現(xiàn)源內(nèi)的二硫鍵還原。這里我們利用半導(dǎo)體氧化鈦和葡萄糖提供了一種類似的還原環(huán)境用于二硫鍵斷裂。以人胰島素為例,對(duì)這種源內(nèi)還原作用進(jìn)行了論述。
　　 3.基于激光解析離子化過程光電化學(xué)原理的肽段源內(nèi)氧化還原裂解
　　 在本節(jié)中,激光解析離子化過程中的光電化學(xué)原理被用于源內(nèi)的肽段裂解。采用前述的方法,樣品肽段和

9、葡萄糖一起被點(diǎn)在納米氧化鈦組成的基底上。在激光的輻射下,電子從價(jià)帶躍遷到導(dǎo)帶,并且產(chǎn)生具有氧化能力的空穴和具有還原能力的自由電子,從而進(jìn)一步引發(fā)后續(xù)的氧化還原反應(yīng)。葡萄糖在這里既是電子給體也是空穴導(dǎo)體,因而可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程的發(fā)生在尾焰中的樣品氧化和肽段裂解。在這里,我們觀測(cè)到了強(qiáng)烈的Cα-C鍵斷裂,同時(shí)N-Cα鍵的斷裂有時(shí)也能被觀察到。前者主要產(chǎn)生a,x碎片離子,后者則主要產(chǎn)生c,z碎片離子。我們認(rèn)為Cα-C鍵的斷裂是由空穴氧化引起的,這一

10、氧化過程具體來說有可能是通過電子或者自由基傳遞的形式完成的;而N-Cα鍵的斷裂則是一個(gè)還原過程,與通常報(bào)道的ISD或者ECD過程原理相似。
　　 (二)納米氧化鈦修飾的功能化MALDI靶板用于原位磷酸化肽段富集
　　 在本章中,發(fā)展了一種MALDI靶上的磷酸化肽段富集分析方法。將TiO2納米粒子修飾在一塊不銹鋼靶板上,就可以形成陣列狀的具有極大比表面積和功能化的靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)被用來從肽段混合物中選擇性的富集磷酸化肽段,之

11、后就可以直接對(duì)這些固定在靶點(diǎn)上的磷酸化肽段進(jìn)行MALDI-MS分析。Beta-酪蛋白和蛋白混合物被作為樣品分析該方法的選擇性和靈敏度。在這種靶上的富集方法中,磷酸化肽段的捕獲、純化和后續(xù)的質(zhì)譜分析都是在一塊靶板上完成的,這樣就大大地避免了樣品的流失并簡(jiǎn)化了分析步驟。由于具有很高的選擇性和很低的檢測(cè)限,該靶上富集方法可能用于磷酸化肽段的在線檢測(cè)分析,這對(duì)于高通量的蛋白質(zhì)學(xué)研究有著重要的意義。更進(jìn)一步的,我們還通過印刷的方式把TiO2修飾在

12、了鋁箔上,然后把修飾好的鋁箔負(fù)載在MALDI靶板的表面,從而避免了對(duì)靶板本身的修飾和再清潔。該鋁箔可以被一次性使用和大量重復(fù)生產(chǎn),因而使得該靶上富集方法有著更大的應(yīng)用前景。
　　 (三)基于介孔材料納米限域的快速蛋白酶解
　　 在本章中,發(fā)展了基于功能化介孔材料CNS的納米酶反應(yīng)器用于解決傳統(tǒng)溶液蛋白酶解動(dòng)力學(xué)過程慢的問題。具有18nm平均孔徑的腈基修飾介孔氧化硅被證實(shí)為一個(gè)很好的胰蛋白酶的載體。肌血球蛋白和細(xì)胞色素C的

13、快速酶解被作為實(shí)例證實(shí)該方法的可行性。此外,該酶反應(yīng)器還被用于生物實(shí)際樣品人肝細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)組的研究,展示了很好的效果?；|(zhì)輔助激光解析時(shí)間飛行質(zhì)譜被用來分析酶解產(chǎn)生的肽段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種基于CNS胰蛋白酶納米反應(yīng)器的酶解比傳統(tǒng)溶液酶解速率要快很多,這一加速效應(yīng)可以歸結(jié)為一種納米尺度的限域作用以及底物、酶的局部濃度富集作用。通過二十分鐘的納米限域酶解,我們成功的鑒定了濃度只有2ng/μl的蛋白。該酶反應(yīng)器還被進(jìn)一步用于酶解人肝細(xì)胞質(zhì)生物