兩種不同分離、純化方法對SD大鼠BMSCs生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的:
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種存在骨髓中,來源于中胚層,且具有多向分化潛力的成體干細(xì)胞。在特定的誘導(dǎo)條件下可以向中胚層來源的各種細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞分化。近年來隨著對BMSCs的深入研究,發(fā)現(xiàn)BMSCs也具有跨胚層分化的潛能,BMSCs移植入活體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可以存活并可分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,體外實驗已證實在一定的誘導(dǎo)條件下BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可不同程度的改善顱

2、腦損傷、腦卒中等疾病的神經(jīng)功能的缺損狀態(tài)。因此,BMSCs是一種十分理想的移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞,具有十分重要的臨床應(yīng)用價值與前景。本研究目的就是探討通過比較觀察使用①密度梯度離心提取+胎牛血清貼壁培養(yǎng)法②全骨髓胎牛血清貼壁培養(yǎng)法這兩種方法提取、培養(yǎng)SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)特性、細(xì)胞表型等生長增殖和生物活性各方面有無差異,從而評價兩種方法的優(yōu)勢與劣勢,以期待尋找一種更好的提取、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

3、　　 方法:
　　 在無菌的條件下用密度梯度離心法與全骨髓分別提取4-6周齡的SD大鼠的左、右下肢的BMSCs,繼而用含有10％胎牛血清的LG-DMEM(低糖DMEM)培養(yǎng)擴增BMSCs。用密度梯度離心提取出的原代BMSCs再經(jīng)胎牛血清貼壁培養(yǎng)法傳代后可得到較純化的可大量擴增的BMSCs細(xì)胞系(得到的細(xì)胞為A組);無菌條件下取全骨髓在胎牛血清中貼壁培養(yǎng)后經(jīng)換液、傳代也可得到大量的BMSCs(得到的細(xì)胞為B組)。流式細(xì)胞儀檢測密

4、度梯度離心法與全骨髓兩種方法提取培養(yǎng)的細(xì)胞的CD29+,CD44-,CD45-的表達,鑒定所培養(yǎng)的BMSCs,繪制BMSCs的生長曲線,并比較兩組BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、凍存復(fù)蘇BMSCs后存活率和生長狀態(tài)等。
　　 結(jié)果:
　　 1.A組與B組的BMSCs生物性狀皆較穩(wěn)定,初培養(yǎng)時細(xì)胞皆為圓形,傳代穩(wěn)定后細(xì)胞呈BMSCs典型的梭形,并以漩渦狀排列成長;有典型的特征性的貼壁生長;
　　 2.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測A組與B

5、組的BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物:CD29+CD44-CD45-,結(jié)果A組CD29+(93.24％),CD44-(94.90％),CD45-(94.22％);B組CD29+(92.89％),CD44-(96.70％),CD45-(93.10％),均符合BMSCs的特征;
　　 3.A組與B組BMSCs均貼壁生長,原代臺盼藍染色檢測細(xì)胞活性A組(-x)為89.19％,貼壁法(B組)x為95.27％,并使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0進行

6、統(tǒng)計學(xué)分析,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義;
　　 4.A組細(xì)胞生長特性:BMSCs貼壁生長,原代培養(yǎng)10天達到90％融合,傳代后的BMSCs增殖速度較原代(P0)培養(yǎng)增快,第三代(P3)的BMSCs已基本純化,BMSCs呈典型的梭形,旋渦狀排列生長,隨著傳代,細(xì)胞增殖分化能力減弱;B組細(xì)胞不同于A組在于:P0細(xì)胞為全骨髓細(xì)胞,換液,傳代過程是大幅度純化的主要方法,第四代(P4)細(xì)胞鏡下觀察才可達到基本純化,但得到的細(xì)胞的活性卻強于A組。<

7、br>　　 結(jié)論:
　　 1.密度梯度離心提取和全骨髓胎牛血清貼壁培養(yǎng)這兩種方法提取、培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀進行表面標(biāo)志物鑒定符合BMSCs的特征;獲得的BMSCs純度較高,在顯微鏡下觀察兩組BMSCs的形態(tài)及生長狀態(tài)相似;
　　 2.密度梯度離心提取間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活力低于全骨髓法(存在統(tǒng)計學(xué)差異),這種差異可能與過程中的多次離心及洗滌對細(xì)胞造成丟失及損傷等原因有關(guān);
　　 3.全骨髓法與密度梯度離心提取法相