T輔助細(xì)胞亞群聯(lián)合檢測對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情評(píng)估價(jià)值的研究.pdf

1、研究背景：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為主要表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。臨床主要特征是多個(gè)器官、系統(tǒng)受累和血清檢測到多種自身抗體（以抗核抗體為代表）。SLE病程遷延，病死率高，病因至今未明,也無特異有效的治療方法。SLE發(fā)病過程中同時(shí)存在細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)紊亂兩種形式，而T淋巴細(xì)胞的異常并導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的過度活化，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的異常應(yīng)答是其主要發(fā)

2、病機(jī)制。近年來國內(nèi)外對(duì)SLE的免疫紊亂研究趨于深入，多項(xiàng)研究認(rèn)為由于SLE患者自身淋巴細(xì)胞平衡被打破，過度活化的T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致多克隆B細(xì)胞分化和激活，從而產(chǎn)生大量自身抗體引起多系統(tǒng)損害受累。目前認(rèn)為的T淋巴細(xì)胞的異?？赡苁荢LE發(fā)病的重要因素。有研究表明SLE患者Th的凋亡顯著增加，且凋亡水平與疾病活動(dòng)性相關(guān)，因此，T輔助淋巴細(xì)胞（Th）的數(shù)量及功能失衡是T淋巴細(xì)胞免疫功能異常的重要方面。Th淋巴細(xì)胞不是單一的一種細(xì)胞群，而是包含了一系

3、列具有不同職能的細(xì)胞亞群，幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞可以分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，四種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以及在體內(nèi)免疫作用各不相同。因此，這些不同職能的細(xì)胞亞群在分化、發(fā)育及功能執(zhí)行等方面存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，需要對(duì)Th細(xì)胞亞型在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病因機(jī)制方面發(fā)揮的作用進(jìn)行深入細(xì)致的研究，才能有助于進(jìn)一步明確Th細(xì)胞在SLE的作用。早期，人們僅僅關(guān)注于Th1/Th2的失衡狀態(tài)與SLE的發(fā)病關(guān)系。認(rèn)為Th1/Th2

4、的平衡狀態(tài)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中起著決定性的作用，其間，“Th2優(yōu)勢(shì)”、“Th1優(yōu)勢(shì)”等多種免疫紊亂狀態(tài)均在狼瘡動(dòng)物模型及患者體內(nèi)被證實(shí)。但隨著對(duì)SLE研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多SLE臨床征象和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)不能用已知的Th1/Th2失衡模式來解釋。近年來對(duì)T輔助細(xì)胞亞群的認(rèn)識(shí)更加全面，在原有Th1/Th2細(xì)胞亞群基礎(chǔ)上，Sakaguchi和Harrington先后在1995年和2005年又發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th17兩個(gè)新成員。逐漸發(fā)現(xiàn)

5、Th17/Treg的平衡狀態(tài)在SLE的疾病過程中發(fā)揮著重要作用。兩者同屬于Th細(xì)胞，但分化相互抑制，生物學(xué)表現(xiàn)完全相反。Th17啟動(dòng)自身免疫疾病發(fā)生, Treg細(xì)胞可減輕自身免疫病反應(yīng),兩者相互拮抗相互抑制維持機(jī)體免疫狀態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定。Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞均參與了SLE的致病過程，并且Th1/Th2、Th17/Treg的失衡狀態(tài)可能導(dǎo)致SLE患者細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引起B(yǎng)細(xì)胞異?；罨?，促發(fā)和加劇SLE病情變化。研究顯示，T

6、h17/Treg細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中可能更為嚴(yán)重，從而在某種程度上，兩組細(xì)胞平衡狀態(tài)可以作為SLE疾病活動(dòng)和病情評(píng)價(jià)的可靠指標(biāo)。故將Th1/Th2、Th17/Treg作為一個(gè)觀察整體，可能比單純研究某類細(xì)胞的變化來推斷SLE疾病狀態(tài)更加科學(xué)系統(tǒng)?？傊狙芯繌腡h細(xì)胞的凋亡情況入手，深入分析Th1/Th2，Th17/Treg在SLE中的失衡狀態(tài)，并相對(duì)全面系統(tǒng)分析Th1/Th2，Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子譜變化特點(diǎn)

7、，并對(duì)新成員Th17/Treg的特異轉(zhuǎn)錄因子的平衡狀態(tài)進(jìn)一步探究，以期通過相對(duì)較大樣本的SLE病例資料，聯(lián)合測定Th細(xì)胞亞群細(xì)胞、蛋白、基因水平變化及相應(yīng)的SLE的疾病活動(dòng)指標(biāo)，探討Th細(xì)胞亞群與SLE疾病活動(dòng)性臨床癥狀的關(guān)系及其對(duì)病情評(píng)估的價(jià)值。
　　 目的：（1）通過比較系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間的Th細(xì)胞凋亡情況，分析SLE患者Th細(xì)胞的凋亡與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)的關(guān)聯(lián)。（2）通過比

8、較系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間的Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡情況，分析Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞與SLE的關(guān)系。（3）系統(tǒng)分析SLE患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間的Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步驗(yàn)證Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞與SLE的關(guān)系。（4）初步研究SLE患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間

9、的Th17/Treg分化路徑上游特異的轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3水平，進(jìn)一步驗(yàn)證Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞與SLE的關(guān)系。深入了解Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在SLE發(fā)病及病情進(jìn)展過程中的意義。
　　 方法：病例選取2009年6月至2010年9月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和中國人民解放軍第264醫(yī)院風(fēng)濕科就診SLE患者89例，診斷均符合1997年修訂的美國風(fēng)濕學(xué)會(huì)（American College ofRheumatolo

10、gy,ACR）分類標(biāo)準(zhǔn)。收集SLE患者一般情況和臨床資料，根據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）積分評(píng)估疾病的活動(dòng)性，并結(jié)合臨床癥狀將患者分為輕型SLE、中度活動(dòng)型、重型三組。同時(shí)選取正常對(duì)照組27名，均不符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)；無其他重大疾病史；未長期應(yīng)用激素或免疫抑制劑；受檢者本人或直系的親屬未患有自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)在獲得研究對(duì)象知

11、情同意后，抽取外周靜脈血。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SLE患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間Th細(xì)胞凋亡率和Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞水平。采用流式細(xì)胞微球捕獲技術(shù)（CBA）和ELSIA測定SLE患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ，IL-17A和TGF-β水平采用RT-PCR檢測SLE患者和正常對(duì)照之間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型

12、患者之間血清Th17/Treg特異轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3 mRNA表達(dá)水平采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：（1） 流式細(xì)胞術(shù)來測定Th細(xì)胞的凋亡情況顯示SLE患者和正常人CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡率分別為（1.11±0.36）％和（0.36±0.15）％，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。輕型、中型、重型SLE患者組和正常對(duì)照組Th細(xì)胞凋亡率分別為（0.81±0.19）％、（1.03±0.2

13、1）％、（1.51±0.31）％和（0.36±0.15）％，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）（2）流式細(xì)胞術(shù)測定四種Th細(xì)胞情況：SLE患者組Th1顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049）。SLE患者組Th2與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重型SLE患者Th1/Th2與中度活動(dòng)組及輕型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：Th2/CD4+與SLEDAI呈正相關(guān)（r=0.4012, P=0.0001）,Th1/Th2

14、與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2683，P=0.0130）。SLE患者組Th17與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Th17占CD4+T細(xì)胞兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），患者組比例較正常人高。SLE患者組Treg低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023)。重型SLE患者Th17、Th17/CD4+、Treg與正常對(duì)照組及輕型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：SLEDAI與Th17、Th17/CD4+和Th17/T

15、reg呈正相關(guān)（r=0.3608,P=0.0006, r=0.4522, P＜0.001,r=0.4240, P＜0.001），與Treg呈負(fù)相關(guān)（r=-0.352, P=0.0010）。（3）相關(guān)細(xì)胞因子測定結(jié)果：流式細(xì)胞微球捕獲技術(shù)（CBA）測定SLE患者組與正常對(duì)照組IL-17、IL-10、IL-6、IL-4比較顯著增高（P均<0.05）其余細(xì)胞因子比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：IL-17、IL-6、IL-4與SLEDAI

16、呈正相關(guān)，IL-2、IFN-γ與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)，尚不能認(rèn)為TNF、IL-10與SLEDAI有相關(guān)性。IL-17在不同活動(dòng)度組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在SLE重型患者中增高最為明顯（F=52.660，P＜0.001）。IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2在不同活動(dòng)度組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNF-α水平在不同活動(dòng)度組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA測定TGF-β結(jié)果顯示SLE患者和正常對(duì)照之

17、間，SLE輕型、中度活動(dòng)及重型患者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.150，P=0.157）。相關(guān)性分析顯示：尚不能認(rèn)為TGF-β水平與SLEDAI有相關(guān)性（r=-0.071，P=0.5150）。（4）RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SLE患者Th17、Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt、Foxp3的mRNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后均有所表達(dá)。SLE組ROR-γt、Foxp3的mRNA表達(dá)變化倍率顯著高于正常對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t

18、=-2.656，P=0.012；t=-2.873，P=0.007）。不同活動(dòng)度SLE患者組間ROR-γt mRNA表達(dá)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.335，P=0.047），F(xiàn)oxp3 mRNA組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.119，P=0.129）。相關(guān)性分析顯示：ROR-γt與SLEDAI、Th17呈正相關(guān)（r=0.4969, P=0.0038, r=0.3960, P=0.0992），尚不能認(rèn)為與其他相關(guān)Th細(xì)胞及細(xì)胞因子有

19、相關(guān)性, 同時(shí)尚不能認(rèn)為Foxp3與SLEDAI及相關(guān)Th細(xì)胞及細(xì)胞因子有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：SLE患者存在Th細(xì)胞凋亡異常情況，且Th細(xì)胞凋亡率與SLEDAI 評(píng)分有顯著相關(guān)性。Th2/CD4+、Th17、Th17/CD4+、Th17/Treg與SLEDAI呈正相關(guān)，Th1/Th2、Treg與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞因子檢測IL-17、IL-6、IL-4與SLEDAI呈正相關(guān)，IL-2、IFN-γ與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)，T