高危型HPV感染及不同級別宮頸病變女性陰道菌群多樣性分析.pdf

1、宮頸癌是威脅全世界女性健康最為嚴重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居女性生殖道惡性腫瘤的首位。目前研究已經證實，高危型人乳頭瘤病毒（High-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持續(xù)感染是宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌發(fā)生的必要條件。當陰道感染HPV病毒后，大多數女性的陰道微環(huán)境可以自行將病毒清除。只有少數女性的HPV病毒可以長時間存在

2、于陰道微環(huán)境中，經過5-10年的時間，最終發(fā)展為CIN及癌變。因此，在這個過程中可能還有其它致癌因素或協(xié)同HPV作用的因素存在，導致宮頸感染HPV的易感性增加，HPV感染得以持續(xù)存在，最終導致癌變發(fā)生。
　　陰道菌群作為維護陰道微環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，其在HR-HPV持續(xù)感染過程中是否扮演一定作用一直被人們所關注，不同研究的結果也不盡相同。陰道微生物研究的關鍵在于陰道菌群的鑒定，早期的研究主要建立在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的基礎上。女性的生殖道

3、是一個相對密閉的環(huán)境，陰道微生物以厭氧菌為主，培養(yǎng)條件和營養(yǎng)需求要求嚴苛，導致目前很大一部分細菌仍然無法分離培養(yǎng)及鑒定，因此使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴方法難以全面的認識陰道微生物的群落結構。近年來，隨著非培養(yǎng)依賴的分子生物學技術的發(fā)展與進步，如熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，使人們對陰道菌群的認識取得了突破性進展。但是這些較傳統(tǒng)的分子生物學技術仍然具有

4、其局限性，不僅研究工作量大、所需時間長，且不能完整的反映整個微環(huán)境中細菌群落的結構信息，甚至存在重要信息缺失的可能。
　　Barcoded Paired-End Illumina Sequencing(BIPES)法是基于Illumina Solexa高通量測序平臺，結合16S rRNA標簽序列分析微生物群落的新一代測序方法，具有操作簡單、成本低廉、重現性好等諸多優(yōu)點，能簡便、快捷的獲得系統(tǒng)的、結構化的、全面的菌群信息。本研究利用

5、這一新的測序方法，對HR-HPV感染女性和健康女性的陰道菌群進行檢測，更加準確及全面的認識HR-HPV感染女性與健康女性陰道菌群物種多樣性和群落結構，探討HR-HPV感染與陰道菌群之間的關系。同時，通過對不同級別宮頸病變女性的陰道菌群進行分析，了解不同級別宮頸病變女性陰道微生物的分布特征、群落結構及宮頸病變發(fā)生發(fā)展中各微生物種群的動態(tài)變化，以期為進一步研究宮頸病變的病因、發(fā)生發(fā)展過程中陰道微生態(tài)療法及益生菌制劑的開發(fā)提供理論基礎。

6、>　　研究目的:
　　1.借助Illumina高通量測序平臺及BIPES的序列研究方法，分析HR-HPV感染女性和健康女性陰道微生物的菌群構成及其多樣性，比較HR-HPV感染女性和健康女性陰道菌群的差異，探索HR-HPV感染與陰道菌群的關系。
　　2.通過對不同級別宮頸病變女性的陰道菌群進行分析，了解宮頸病變不同階段的陰道微生物分布特征及群落結構，追蹤宮頸病變發(fā)生發(fā)展過程中各微生物種群的動態(tài)變化，探尋陰道菌群的動態(tài)變化與宮頸

7、病變發(fā)生發(fā)展的關系。
　　研究方法:
　　第一章:
　　1.研究對象
　　選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科健康體檢或診治的女性，根據HR-HPV篩查(hC2法)結果分為2組:①HPV陰性組（HPV-組）33例:均為健康體檢者，HR-HPV檢查均陰性;②HPV陽性組(HPV+組)98例:HR-HPV均陽性。
　　納入標準:年齡21-65歲;有性生活史3年及以上;非月經期、妊娠期

8、及產褥期婦女。排除標準:年齡＞65歲;無性生活史者;合并免疫缺陷疾病者;合并全身系統(tǒng)性疾病者:糖尿病、激素治療性疾?。甭阅I炎等）等。同時需滿足以下條件:48h內無陰道沖洗;3d內無性生活史、陰道放藥史;1個月內未系統(tǒng)性使用抗生素或抗真菌藥。
　　2.標本采集:以無菌棉拭子于陰道穹窿或陰道中段側壁處留取分泌物，用于16S rRNA基因提取。
　　3.總DNA提取:采用陰道拭子基因組DNA試劑盒提取樣本總DNA，具體步驟參考

9、說明書。DNA提取后置于-20℃冰箱保存。
　　4.16S rRNA-V4區(qū)的PCR擴增及Illumina測序:以提取的DNA為模板，擴增其16S rRNA V4區(qū)的基因片段。將擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳及紫外熒光定量后，以相等的終濃度將PCR產物混合均勻，送至深圳華大基因進行雙末端100bp測序，測序平臺為Illumina HiSeq2000。
　　5.對原始測序數據以BIPES程序進行預處理。通過兩階段聚類（Two-sta

10、ge-clustering，TSC）的分析方法提取出每個操作分類單元(operationaltaxonomy units，OTU)的代表序列，然后再利用GAST對OTU進行歸類，用于樣品間的相似性分析，主要包括Alpha多樣性、Beta多樣性及菌群結構分析。通過linear discriminant analysis(LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線分析工具分析兩組間

11、陰道菌群群落結構及菌屬差異。
　　6.統(tǒng)計學處理:應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組計量資料間的比較采用兩獨立樣品的t檢驗，對多樣性指數應用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　第二章
　　1.研究對象
　　選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科健康體檢或診治的女性，根據宮頸液基細胞學、HR-HPV篩查(hC2法)和宮頸活檢病理結果分為4組:

12、①正常組（N組）33例:均為健康體檢者，宮頸細胞學及HR-HPV檢查均陰性;②低級別組（L組）26例:HR-HPV檢查陽性;和/或宮頸活組織檢查確診為低級別宮頸上皮內瘤變;③高級別組(H組)40例:HR-HPV檢查陽性，宮頸活組織檢查確診為高級別宮頸上皮內瘤變;④宮頸癌組（C組）32例:HR-HPV檢查陽性，宮頸活組織檢查確診為宮頸癌。
　　納入標準與排除標準與“第一章”相同。
　　標本采集、總DNA提取、PCR擴增、PCR

13、產物測序和數據處理與“第一章”相同。統(tǒng)計學處理時多組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、LSD兩兩檢驗，余與“第一章”相同。
　　研究結果:
　　實驗一
　　1.本實驗測序樣品數131個，共獲得971007條序列，平均每個樣品7412條。
　　2.采用PD_ whole_ tree(PD)和Shannon兩個多樣性指數來比較HPV-組和HPV+組陰道菌群Alpha多樣性的差異。結果顯示HPV

14、+組的PD指數和Shannon指數均增高，且兩組間Shannon指數的差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　3.在菌屬水平上，HPV-組以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌屬，占81.54％。HPV+組的菌群結構呈多樣性改變，乳酸桿菌屬含量顯著下降，僅占40.48％，同時加德納菌屬相對豐度顯著增加，由3.01％增加至19.87％。普氏菌屬、奇異菌屬、消化鏈球菌屬等多種厭氧菌屬和脲原體屬、支原體屬相對豐度也增加。
　　4.利用QIIME軟

15、件進行兩組間的Beta多樣性分析顯示，兩組陰道微生物的總體菌群結構在Weighted_unifrac距離的聚類結果可顯著的區(qū)分為2個不同的部分。
　　5.通過LEfSe分析兩組間差異菌屬發(fā)現，乳酸桿菌屬在HPV-組中富集，而加德納菌屬、普氏菌屬、奇異菌屬、厭氧球菌屬、擬桿菌屬、不動桿菌屬等厭氧菌屬在陽性組中富集，且于HPV+組中檢測到布魯氏菌屬的存在。
　　實驗二
　　1.本實驗測序樣品數131個，共獲得971007條

16、序列，平均每個樣品7412條。
　　2.采用PD_ whole_tree(PD)和Shannon兩個多樣性指數對四組陰道菌群的Alpha多樣性進行分析。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，陰道微生物的Alpha多樣性逐漸增加，菌群的群落結構發(fā)生顯著變化，且于宮頸癌組患者中陰道微生態(tài)改變達最大化。
　　3.在屬水平上，隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，乳酸桿菌屬相對豐度逐漸下降;加德納菌屬的比例先驟增而后逐漸降低;大量低豐度、未知菌屬的含量逐漸增加

17、;多種厭氧菌屬所占比例也有不同程度的增加。
　　4.通過LEfSe進行各組間差異菌屬分析發(fā)現，加德納菌屬、支原體屬、脲原體屬主要在低級別組富集，高級別組和宮頸癌組主要富集多種厭氧菌屬。
　　5.四組陰道菌群的總體結構在Weighted_unifrac距離的聚類結果有差異。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，與正常組的距離逐漸拉開，直至顯著的區(qū)分為2個不同的部分。相鄰兩組間的陰道微生物存在某些相似的菌群構成，但同時具有相互分開的趨勢。